造血-间充质信号调节间充质干细胞的特性

骨髓间充质干/基质细胞（MSCs）存在于骨髓中，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞，是再生医学中临床上使用最多的干细胞之一。然而，间充质干细胞在骨髓中仅有少量存在（约为两百万分之一），为了获得所需数量的细胞，必须培养MSCs才能扩增，但这会导致干细胞特性（干性）显著降低，例如分化多能性和增殖能力。目前，旨在阐明MSC自我更新和干性维持的分子机制的研究正在取得进展。然而，在维持干细胞干性的同时建立培养MSCs的方法仍然具有挑战性。如果能够建立这样的方法，MSCs在临床应用中的使用将大大扩展。

骨髓中的间充质细胞提供了一个称为生态位（niche）的微环境，其中造血干细胞/祖细胞（HSCs）的干性由各种因素维持，例如C-X-C基序趋化因子配体12（CXCL12）和透明质酸。这些间充质细胞被认为对应于巢蛋白阳性细胞、N-钙黏蛋白阳性细胞、CD31阳性细胞和表达CXCL12的网状细胞。众所周知，促血小板生成素（TPO）对巨核细胞生成至关重要，有助于HSCs的维持和扩增。缺少TPO或其受体（c-Mpl）的小鼠不仅显示巨核生成受损，而且HSC数量和功能降低。最近的报道表明，需要TPO来维持骨髓内HSCs的静息状态。

细胞间相互作用在各个发育阶段和组织稳态维持中起着关键作用。在个体发育和器官发展过程中，不同胚层的细胞之间经常观察到这种相互作用。研究表明，从HSCs到MSCs的干性信号也存在，作为间充质谱系HSCs的干性信号的对应物。因此，东京大学医学部口腔颌面外科、东京医科齿科大学齿学研究科以及德克萨斯大学休斯顿健康科学中心的联合研究人员假设TPO / c-Mpl信号对于从HSCs到间充质细胞的干性信号也很重要，在一项研究中，利用c-Mpl缺失小鼠来检测HSCs和MSCs中c-Mpl缺失对其增殖能力和干性维持的影响。相关研究成果发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells”。

首先，为了验证造血-间充质细胞相互作用的存在，将表达EGFP的小鼠骨髓来源的间充质细胞（BM细胞）与人急性骨髓性白血病细胞（KG-1细胞系）共培养，然后计算了一段时间内共培养的细胞数量，发现与KG-1细胞的直接共培养刺激了BM细胞的增殖。相比之下，间接共培养对BM细胞增殖影响不大（图1 A、B）。KG-1细胞增殖不受与BM细胞共培养的影响（图1 A、B）。

已知MSCs 在体外培养过程中会经历加速分化。有和没有与KG-1细胞共培养的细胞之间的形态无显著差异（图1 C）。因此，检测了血小板衍生生长因子受体（PDGFR）α 和干细胞抗原-1（Sca-1）以及MSC特异性标志物在小鼠中的表达。在与KG-1细胞共培养的细胞（BM细胞+ KG-1细胞）中表达PDGFR-α和Sca-1的细胞比例明显高于未与KG-1细胞共培养的细胞（BM细胞）（图1 D）。然后进一步研究了共培养对多谱系分化能力的影响。共培养后诱导软骨细胞分化，在BM细胞中观察到Sox9的表达（图1 E）。这些数据表明，BM细胞与KG-1细胞的共培养可促进其增殖和软骨细胞分化能力。

图1 间充质-造血细胞相互作用促进BM细胞增殖。

接下来，为了再次确认造血-间充质细胞相互作用对MSCs的影响，实验评估了与HSCs共培养过程中MSC特性的变化。结果表明，与HSCs直接共培养促进了MSCs的增殖，而间接共培养无影响。有趣的是，造血细胞显示出细胞数量的显著增加，特别是在在间接共培养过程中。然后检测了它们在共培养增殖的间充质和造血细胞中的比例，观察到从第0天开始，MSC标记阳性细胞显示出随时间而略有增加的趋势，而HSCs细胞的数量在共培养后立即大幅下降。此外，还评估了MSCs在共培养后的多能性，观察到在诱导成骨、成脂和成软骨分化后，各分化标志物的表达上调。这些数据表明，直接间充质-造血细胞相互作用促进了MSCs的干性，而且从HSCs 转变到MSCs 时存在一个信号。

为了更详细地研究HSC信号对MSCs的影响，使用微阵列分析检查了与HSCs共培养后MSCs的基因表达谱。在MSC和HSC共培养组和仅MSC组（对照）中，观察到转录因子的上调。这些MSCs表达SRCIN1、BNC1和PCK1。SRCIN1调节细胞扩增和迁移；BNC1参与卵母细胞成熟的正向调节，也可能在胚胎的早期发育中发挥作用；PCK1通过其蛋白激酶活性调节脂肪生成。基于此，HSCs可能具有维持MSCs的未分化特性和代谢的潜力。此外，还分析了差异表达基因（DEGs）。然而，在对照组与共培养组之间未观察到DEGs。然后进行了基因集富集分析（GSEA）以检测信号趋势。对C2_curated基因集（标志性基因集）进行分析的结果发现，以下富集的基因存在显著差异：“I型胶原蛋白合成”、“脂肪生成”、“Wnt blocked by Frizzled”和“H3K27me3”，这些基因在共培养的MSCs中受到抑制。GSEA分析结果支持HSC信号可能会影响MSC特性。

据报道，MPL信号是维持HSCs未分化状态的直接机制之一。为了确定c-Mpl缺失小鼠的干性信号对MSCs的影响，分析了c-Mpl敲除小鼠的细胞。首先，从c-MPL缺失和野生型小鼠中收获MSCs，以检查HSC缺失对MSCs的影响。在CFU-F测定中，c-Mpl缺失小鼠来源的MSCs显示出与野生型小鼠细胞相当的集落形成能力（图2 A、B）。当收获的细胞传代培养时，两种细胞类型之间的增殖能力或PDGFR-α/Sca-1阳性细胞的比例没有显著差异（图2 C、D）。此外，通过实时RT-PCR检测MSCs的多能性，惊讶的是，在c-Mpl缺失小鼠来源的MSCs中观察到软骨标志物表达的显著增加。虽然两组之间成骨标志物和成脂标志物的表达没有显著差异，但这些标志物在c-Mpl缺失小鼠的MSCs中往往更高（图2 E-G）。这些结果表明，c-Mpl缺失的MSCs在体外表现出增强的分化活性。

图2 c-MPL缺失的MSCs具有正常的增殖和分化潜力。

然后，在体内评估了来自c-Mpl缺失和野生型小鼠的MSCs的成骨特性，显示c-Mpl-WT和c-缺失的MSCs在移植后早期出现骨形成。然而，c-Mpl缺失小鼠来源的MSCs比野生型MSCs更早地促进骨形成。苏木精和伊红染色显示第 2 周和 4 周均存在移植物。这说明，c-MPL 基因缺失影响异位骨的维持。

最后，为了研究HSCs的干性与HSCs到MSCs的干性信号之间的关系，将野生型MSCs与野生型小鼠HSCs或c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培养。与HSCs共培养（c-Mpl野生型（WT）和c-Mpl敲除（KO））共培养后，MSCs的集落形成能力不受c-Mpl缺失的影响（图3 A）。然而，与c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培养未能刺激MSC增殖（图3 B）。在未共培养的MSCs中，尽管Sca-1和PDGFR-α阳性率在培养后立即下降，但从第0天到第6天几乎保持不变（图3 C）。在与野生型HSCs共培养的野生型MSCs中，尽管Sca-1和PDGFR-α的阳性率从-2天到第0天暂时下降，但在第3天恢复并维持在40%左右（图3 C）。然后，检测了与c-Mpl缺失或野生型小鼠HSCs共培养的MSCs的多能性。与c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培养的MSCs中成脂标志物水平显著更高，软骨细胞分化标志物的水平也更高。两组成骨标志物表达相似（图3 D）。因此，可以认为在HSCs中，c-Mpl会影响MSCs增殖能力的维持。

图3 HSCs中的c-Mpl调节MSC的特性。

综上所述，这项研究验证了从造血细胞到间充质细胞的干性信号。此外，这表明HSCs的干性对于维持MSCs的干性很重要。该研究结果可能有助于建立一种利用干性信号来扩增具有高干性的间充质干细胞的培养方法，从而为再生医学的发展做出贡献。

参考文献：Kanazawa S, Okada H, Riu D, Mabuchi Y, Akazawa C, Iwata J, Hoshi K, Hikita A. Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2022 Jul 26;23(15):8238. doi: 10.3390/ijms23158238. PMID: 35897814; PMCID: PMC9330127.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35897814/

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