内皮祖细胞通过MAPK-依赖性通路促进共培养的间充质干细胞的成骨分化

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。基于干细胞的骨组织工程技术是再生骨缺损的一种有前途的策略。骨组织工程的基本概念是通过结合生长因子、合适的支架和特定的成骨细胞或其祖细胞来产生新的骨。然而，骨组织是由几种细胞类型及其周围的细胞外基质形成的复杂结构。因此，了解每种细胞类型之间的关系以达到成功的骨再生非常重要。由于这些原因，研究人员已转向共培养研究以增强骨骼再生。

间充质干细胞（MSCs）是组织工程中细胞治疗的重要来源。间充质干细胞通过细胞与细胞间的直接接触诱导直接效应，并分泌趋化因子和细胞因子用于旁分泌和自分泌功能，在组织再生中产生营养支持。内皮祖细胞（EPCs）具有分化为成熟内皮细胞的能力，并且EPCs在血管生成中的作用已在体外和体内得到广泛研究。EPCs能够促进宿主骨缺损的再生，这可能是血管形成增加和参与骨愈合的其他细胞/分子因素的结果。EPCs与MSCs的结合对细胞增殖和分化有深远的影响。研究表明，EPCs和MSCs的共同培养可显著改善骨形成，但MSCs和EPCs在成骨中的关系尚未完全阐明。

因此，中国医科大学附属第四医院口腔科、中国医科大学口腔医学院的一项研究在共培养实验中使用MSCs和EPCs研究它们的成骨相互作用，鉴定驱动这种相互作用的基因表达变化，确定EPCs如何影响MSCs的成骨分化，并研究了丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路在成骨分化中的参与。

首先，内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞经分离鉴定后，设立两种细胞共培养的实验组和骨髓间充质干细胞单独培养的对照组。然后鉴定了成骨诱导过程中EPCs-MSCs 共培养与MSCs单培养组的差异调控基因。差异表达基因的KEGG富集分析表明，许多信号通路，包括MAPK，ECM-受体相互作用，TNF，PI3K-Akt和HIF-1，都受到共培养的EPCs的调控。在这些通路中，MAPK主要受到与EPCs共培养的影响。

接下来，为了研究EPCs对MSCs分化的影响，在成骨诱导培养基中培养MSCs。结果表明，当与EPCs共培养时，MSCs在分化方面表现不同。当MSCs 与EPCs共培养时，观察到ALP（碱性磷酸酶）增加。实验在第1天、第7天和第14天测量ALP活性，数据显示，当MSCs与EPCs共培养时，ALP活性增加，与第1天和第7天相比，第14天时ALP活性最高，EPCs在7 和14 天显著提高了MSCs的ALP活性，分别提高了14.91% 和30.52%（图1 a）。

在第14天进行qRT-PCR定量成骨基因表达，包括Runx2、OPN和BSP，以研究EPCs对MSCs分化的影响。结果表明，与单层间充质干细胞相比，EPCs在共培养的MSCs中显著提高了42.16% 的OPN mRNA表达，BSP和Runx2 mRNA水平在共培养的MSCs中也分别显著提高了29.87% 和34.52%（图1 b）。

这些数据表明，EPCs增加间接共培养的MSCs的成骨基因表达。

图1 EPCs促进MSCs的成骨分化。

（a）在诱导成骨分化后第7、14和21天通过ALP染色确定成骨分化。（b）在成骨分化诱导后第14天通过qRT-PCR测量成骨基因OPN，BSP和Runx2的表达。（c）EPCs促进MSCs的MAPK信号通路的激活，通过蛋白质印迹检查p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK表达。（d）通过免疫印迹法测定p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白质水平，β-肌动蛋白作为内对照。

此外，qRT-PCR和蛋白质印迹法用于评估MAPK通路是否参与成骨。与单独培养的MSCs相比，与 EPCs共培养的MSCs中的p38磷酸化水平显著上调。然而，JNK和ERK1/2磷酸化水平没有显著改变（图1 c、d）。qRT-PCR数据显示，在MSCs-EPCs共培养组中，p38基因表达显著上调75.27%。在MSCs-EPCs共培养组中，TAB1和MKK6基因表达也显著上调116.93% 和112.51%（图1 e）。这些数据表明，EPCs 促进 TAB1、MKK6 和 p38 基因表达以及 p38 磷酸化。

为了进一步研究EPCs是否通过MAPK信号通路促进MSCs的成骨分化，实验使用了p38信号抑制剂SB 203580，ERK信号抑制剂FR180204和 JNK 抑制剂 SP600125 来评估共培养的 MSCs 中 MAPK 信号通路和成骨分化的变化。用特异性通路抑制剂处理后，测定p38、ERK1/2、JNK的蛋白质及其磷酸化蛋白水平和MSCs的成骨能力。结果表明，通过SB203580、FR180204和 SP600125处理，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平显著降低（图2 a、b）。ALP实验和茜素红染色进一步证实了MAPK信号通路对MSCs成骨分化能力的调控。结果表明，SB203580显著降低了ALP水平和钙结节形成（图2 c-f）。这些数据表明，EPCs通过促进p38 MAPK信号通路激活来参与MSCs 的成骨分化。

图2 EPCs通过促进MAPK磷酸化诱导成骨分化。

（a）MSCs 用p38通路抑制剂SB203580、ERK通路抑制剂FR 180204或JNK通路抑制剂SP600125预处理，然后与EPCs共培养，并通过免疫印迹检查p38、p-p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白质水平。（b）通过免疫印迹法检测p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的相对蛋白水平，β-肌动蛋白作为内对照。（c）通过ALP染色确定成骨分化。（d）钙结节的形成通过茜素红染色测定。（e）相对ALP活性。（f）相对矿化水平。

实验证明了p38信号通路在共培养的MSCs中起着重要作用。在此观察之后，实验最后使用p38 siRNA沉默进一步探索了p38MAPK在促进MSCs成骨分化中的功能。p38 siRNA用于阻止p38MAPK通路激活。结果观察到p38 siRNA添加到细胞后，p38磷酸化水平显著降低。然而，p-JNK和p-ERK1/2表达水平没有显著改变（图3 a、b）。接下来，研究了p38 siRNA对MSCs成骨分化的影响。数据显示，p38沉默显著降低了Runx2、OPN、BSP和Col I蛋白表达水平（图3 c、d）。一致地，ALP水平和钙结节形成均受到p38沉默的抑制（图3 e-h）。因此，EPCs通过激活p38 MAPK信号通路对MSCs的成骨分化具有积极影响。

图3 p38 MAPK信号通路参与MSCs成骨分化。

（a）用siRNA-p38转染MSCs，并通过免疫印迹检查p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白表达，β-肌动蛋白作为内对照。（b）p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK 和 JNK 相对蛋白质水平的密度测定法。（c）免疫印迹法检测OPN、BSP、Runx2 和 Col I 的蛋白表达。（d）OPN、BSP、Runx2和Col I相对蛋白质水平的密度测定。（e）通过ALP染色确定成骨分化。（f）相对ALP活性。（g）通过茜素红染色形成钙结节。（h）相对矿化水平。

总之，这项研究的结果支持EPCs可以在体外增强MSCs成骨分化的观点。EPCs对 MSCs的分化和成骨具有深远的影响，EPCs显著促进了MSCs 的成骨基因表达和蛋白质合成。ALP活性和钙结节形成也显著增加。EPCs的外泌体或旁分泌因子影响MSCs的生物学功能，激活p38MAPK通路可能是增强MSCs成骨分化的关键。对细胞相互作用的进一步了解对于理解体外细胞动力学将是无价的，最终有助于更合理的组织工程策略。

参考文献：Xu C, Liu H, He Y, Li Y, He X. Endothelial progenitor cells promote osteogenic differentiation in co-cultured with mesenchymal stem cells via the MAPK-dependent pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Dec 11;11(1):537. doi: 10.1186/s13287-020-02056-0. PMID: 33308309; PMCID: PMC7731475.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33308309/

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