G3BP1协调溶酶体自噬活性，以防止椎间盘退变过程中压缩诱导的细胞铁死亡

椎间盘退行性变（IDD）是一个慢性炎性状态，其特征是椎间盘（IVD）内的髓核（NP）活细胞丧失和细胞外基质（ECM）破坏。目前，如何提高NP细胞活力，降低死亡率成为IDD治疗发展的紧迫问题。

溶酶体是维持细胞稳态的重要降解细胞器。针对溶酶体损伤，溶酶体自噬作为重要的内源性保护机制，在防止不可逆细胞损伤方面发挥作用。溶酶体自噬是指通过选择性自噬对受损溶酶体有效清除的过程。溶酶体活性维持正确的细胞功能，其失调与多种疾病有关，包括癌症、神经退行性疾病或与衰老相关的疾病。溶酶体损伤参与多种形式的细胞死亡过程，如细胞凋亡、坏死、焦亡及铁死亡等。铁死亡是指铁依赖性脂质过氧化和活性氧（ROS）诱导的调节性细胞死亡。溶酶体通过改变铁摄取和铁排出的水平来调控铁死亡。当涉及到受损的溶酶体和溶酶体自噬活性时，调节机制仍然未知。先前的研究表明NP细胞中存在铁死亡，并初步探讨了其在IDD中的作用。然而，铁死亡相关椎间盘退变的潜在机制很复杂，需要进一步研究。

Ras-GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（G3BP1）是众所周知的应激颗粒成分，在调节细胞衰老、免疫反应和细胞凋亡方面发挥作用。最近的研究表明，G3BP1可以调节雷帕霉素（mTOR）信号通路机制靶点的激活，起到溶酶体系链的作用。这些发现支持G3BP1可以影响溶酶体的功能，可能包括溶酶体的数量和活性。因此，有理由怀疑G3BP1在应力条件下调节溶酶体自噬活性和溶酶体修复。此外，在IDD进展过程中，G3BP1与mTOR信号通路之间的关系仍需在NP细胞中验证。

最近，在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科团队的一项研究中，推测G3BP1通过在IDD过程中调节细胞铁死亡介导溶酶体自噬和溶酶体活性，并进一步研究了G3BP1和mTOR信号在体内椎间盘退变模型中的作用。该研究加深了对NP细胞G3BP1、溶酶体自噬和铁死亡之间关系的认识，为IDD治疗提供了新的靶点。

首先，实验测量了G3BP1和Galectin-3（溶酶体损伤的标志物）在人NP组织中的表达水平。结果表明，在退变NP组织中G3BP1表达水平低，Galectin-3表达水平高，而且G3BP1和Galectin-3 水平均与NP组织的退行性分级相关。这表明，在IDD的进展过程中，G3BP1的水平逐渐降低，溶酶体损伤增加。

压缩力是IDD的常见致病因素。因此实验利用体外静态压缩力装置（1.0 MPa）来模拟NP细胞周围的外部环境。LLOMe（L-亮氨酸甲酯的二肽缩合物）能够在溶酶体中积累，并用于诱导溶酶体损伤。结果观察到，Galectin-3的蛋白质水平在压缩组和LLOMe组中均增加（图1 A），而且压缩力处理诱导Galectin-3阳性溶酶体在NP细胞中的积累（图1 B）。它揭示了NP细胞在压缩压力下溶酶体损伤的增加。另一方面，发现压缩处理增加了NP细胞的死亡率（图1 C）。

为了进一步研究是否发生铁死亡，将NP细胞与DCFH-DA探针一起孵育。结果发现，在加压处理后，细胞ROS水平升高（图1 D），GPX4和FTL的蛋白质水平均降低（一些蛋白质，如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁蛋白轻链（FTL）参与调节细胞铁死亡）（图1 E）。结果表明，在压缩压力下溶酶体损伤伴有细胞铁死亡。同时，加压组细胞游离铁浓度升高（图1 F）。游离铁可能从严重受损的溶酶体中释放出来。脂质ROS水平表示脂质过氧化的程度，这是铁死亡的标志。结果表明，压缩和LLOMe处理均诱导脂质ROS水平升高（图1 G、H）。这些结果表明，压缩处理诱导溶酶体损伤，进而加重NP细胞的铁死亡。

图1 加压处理诱导溶酶体损伤和NP细胞铁死亡。

Trim16 是一种 E3 泛素连接酶，在溶酶体自噬起始中发挥作用，并募集接头蛋白 VCP/p97来诱导溶酶体自噬。接下来，实验观察到Trim16和p97的水平在加压期间发生了变化。长时间的压力处理似乎损害了溶酶活性以及G3BP1的水平。为了进一步揭示G3BP1在溶酶体自噬中的作用，siRNAs被用来敲低G3BP1的表达。结果表明，G3BP1敲低降低了Trim16的表达并诱导了p97的积累。同时，溶酶体自噬活性降低与ROS水平升高有关。G3BP1敲低组的细胞游离铁和脂质过氧化水平升高。这表明G3BP1功能障碍加重细胞铁死亡。实验发现G3BP1功能障碍诱导Galectin-3的积累和溶酶体损伤，这对于在压缩压力下加剧铁死亡至关重要。

G3BP1被认为是组装应激颗粒（SGs）的中心开关。因此打算确定G3BP1是否参与压缩压力下的SG的形成。亚砷酸盐可诱导应激颗粒组装。结果表明，压缩组G3BP1相关SG的形成不如亚砷酸盐组明显。这表明，G3BP1更可能作为溶酶体活性的调节剂，同时在压缩压力下也可能充当SG成分。

哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白（mTOR）信号控制溶酶体代谢途径。因此怀疑G3BP1通过mTOR信号调节溶酶体活性。结果表明，在压缩压力下磷酸化的mTOR水平降低，表明mTOR信号受到抑制（图2 A）。NP细胞用mTOR信号激活剂MHY1485或特异性mTOR抑制剂雷帕霉素处理。结果发现溶酶体自噬活性同时被mTOR激活剂抑制，并被mTOR抑制剂激活（图2 B）。此外，MHY1485处理还诱导NP细胞中ROS水平升高（图2 C）。mTOR激活组细胞游离铁浓度和脂质ROS水平升高，在mTOR抑制组降低（图2 D-F）。细胞死亡率在MHY1485组显著升高，在雷帕霉素组降低（图2 G）。这表明，mTOR信号传导的激活加重了细胞铁死亡，这与G3BP1敲低的效果相似。此外，MHY1485处理促进溶酶体损伤，而雷帕霉素改善了溶酶体损伤（图2 H、I）。这些结果表明，G3BP1通过mTOR信号调节溶酶体自噬和细胞铁死亡。

然后，为了进一步研究G3BP1在mTOR信号中的作用，研究人员打算揭示G3BP1与mTOR复合体的结合。实验观察G3BP1与mTOR亚基TSC2的结合。TSC2的敲低诱导磷酸化mTOR水平升高，显著抑制溶酶体自噬的活化，降低铁死亡相关保护蛋白的水平，还诱导Galectin-3表达升高，表明溶酶体损伤加重。这些结果表明，G3BP1/TSC2 复合体使 mTOR 信号失活，以调节溶酶体自噬和NP细胞的铁死亡。

图2 G3BP1通过mTOR信号调节溶酶体自噬和铁死亡结果。

最后，为了评估G3BP1对IDD的影响，建立了椎间盘退变模型，将靶向G3BP1的siRNAs注射到大鼠椎间盘中，并评估椎间盘的退变程度。结果表明，G3BP1的敲低促进了IDD在体内的进展。

为了进一步了解IDD进展过程中的G3BP1/mTOR信号，在椎间盘退变模型中使用了靶向mTOR信号的药物。结果表明，MHY1485提高了椎间盘的MRI分级，与IDD组相同（图3 A、B）。MHY1485组椎间盘高度较对照组显著降低（图3 C、D）。然而，雷帕霉素可以部分改善IDD进展过程中水分含量和椎间盘高度的损失。与IDD组相比，雷帕霉素组MRI分级较低，椎间盘高度指数（DHI）较高。此外，MHY1485组和IDD组NP区被纤维组织取代（图3 E）。与MHY1485和IDD组相比，雷帕霉素组的退变分级较低，表明椎间盘的退变特征不太明显（图3 F）。这些结果表明，mTOR 信号失活会延缓体内 IDD 的进展，G3BP1/mTOR信号参与体内IDD的进展，可能为IDD治疗提供潜在的靶点。

图3 mTOR信号传的调控影响体内IDD的进展。

图4 揭示G3BP1在压缩诱导的溶酶体损伤和细胞铁死亡中的保护作用的示意图模型。
G3BP1 协调 TSC/mTOR 复合体以启动溶酶体自噬以去除损伤的溶酶体。在压缩压力下，G3BP1功能障碍促进溶酶体自噬的失活。受损溶酶体的积累诱导游离铁和脂质过氧化水平升高，导致细胞铁死亡。

总之，该研究调查了溶酶体自噬、溶酶体损伤和细胞铁死亡之间的关系。G3BP1作为核心链接协调溶酶体自噬活性以清除损伤的溶酶体，从而抑制细胞游离铁的过载。在压缩压力下，G3BP1似乎主要存在于溶酶体中，通过TSC2 / mTOR信号调节溶酶体功能，而不是形成应激颗粒。这些发现说明了G3BP1和mTOR信号在NP细胞铁死亡中的作用，并可能为IDD提供潜在的治疗靶点。

参考文献：Li S, Liao Z, Yin H, Liu O, Hua W, Wu X, Zhang Y, Gao Y, Yang C. G3BP1 coordinates lysophagy activity to protect against compression-induced cell ferroptosis during intervertebral disc degeneration. Cell Prolif. 2023 Mar;56(3):e13368. doi: 10.1111/cpr.13368. Epub 2022 Nov 30. PMID: 36450665; PMCID: PMC9977669.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36450665/

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