二甲双胍在胰腺导管腺癌3D共培养模型中的抗癌作用

胰腺导管腺癌（PDAC）很难在前期发现，因为它在无症状阶段进展迅速，能早期转移到远处器官。导致PDAC预后不良的主要特征之一是结缔组织增生，其形式为广泛致密的纤维基质和过量的细胞外基质（ECM）。在ECM中，基质金属蛋白酶（MMPs）由胰腺星状细胞（PSCs）和癌细胞分泌。在MMPs的几种亚型中，MMP2主要与促进细胞生长和侵袭有关。

最近的研究表明，二甲双胍是一种具有出色安全性的一线抗糖尿病药物，可以在减少癌症干细胞（CSCs）的数量和各种癌细胞的迁移能力方面发挥作用。例如，在胰腺癌，乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中，二甲双胍已被证明可以在体外和体内抑制肿瘤状态。鉴于其安全性和低成本，二甲双胍辅助治疗可能是改善PDAC预后的一个有吸引力的选择。然而，对其益处机制的研究主要局限于细胞系，这些细胞系无法重现胰腺肿瘤微环境。

在胰腺中，PSCs是促进肿瘤微环境中结缔组织增生反应的中枢细胞。既往研究报道，调控PSCs可改善PDAC的治疗效果。因此，有理由将具有丰富基质的PSCs作为PDAC的重要治疗靶点，这些基质有助于化学耐药性和高侵袭性。

最近，在韩国成均馆大学医学院三星医学中心内分泌与代谢系、肝胆胰腺外科系以及大邱庆北医疗创新基金会的一项联合研究中，着手确定了二甲双胍在临床相关浓度下的抗癌作用是否可以在由患者来源的PDAC类器官和从术后组织获得的原代人PSCs制成的PDAC三维（3D）共培养模型中得到证明。利用该模型，实验探索了二甲双胍对PSCs的抗迁移作用的关键机制是否是由MMP2下调，以及口服二甲双胍（30 mg/kg）是否可以抑制免疫抑制小鼠PDAC类器官异种移植的生长。相关内容发表在 The American Journal of Cancer Research 期刊题为“Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma”。

首先，为了在体外探索人PDAC的表型，从人PDAC组织中分离出PSCs和PDAC类器官。

为了检测二甲双胍是否会影响与人 PSCs 中迁移和侵袭相关基因的 mRNA 转录水平，在接种细胞一天后向 PSC 生长培养基中加入浓度为 1 μM、10 μM 和 100 μM 的二甲双胍并处理 48 小时。结果表明，二甲双胍处理的 PSCs 表现出波形蛋白、MMP2 和金属蛋白酶2组织抑制剂（TIMP2）的表达水平降低，这是迁移和侵袭的关键因子。二甲双胍剂量依赖性地降低了CD10、CD24和CD44的转录水平，这是各种肿瘤的基质预后标志物。基于定量PCR分析，检查了浓度为10 μM二甲双胍的PSCs的形态变化和细胞活力，发现对照组和二甲双胍处理组之间在48小时内没有显著差异。

为了研究二甲双胍是否可以抑制人PSCs的迁移能力，进行了细胞迁移测定。与对照和1 μM二甲双胍相比，10 μM二甲双胍显著抑制细胞迁移形成的圆形无细胞区的封闭（图1 A、B）。这些结果在不同N期PDAC患者的PSCs中是可重复的（图1 C、D）。此外，研究了MMP2的蛋白质表达和酶活性。在不同N期PDAC患者的PSCs中，MMP2蛋白水平和酶活性在对照组和二甲双胍组之间存在显著差异（图1 E、G）。二甲双胍对CD10的蛋白质表达具有抑制作用，CD10是一种促进癌细胞进展的基质干细胞标志物（图1 F）。这些数据表明，二甲双胍可以抑制人类PSCs的迁移能力和MMP2和CD10的表达水平。

图1 二甲双胍抑制 PSCs 的迁移能力及其对 MMP2 和 CD10 的表达。

接下来，探讨了转化生长因子-β（TGF-β）信号通路（肿瘤迁移中的主要信号通路之一）在二甲双胍降低PSCs中MMP2表达的能力中所起的作用。为了确认PSCs，PDAC类器官以及共培养的PSCs和PDAC类器官分泌TGF-β，将其培养48 h并检测TGF-β的分泌。结果发现，二甲双胍处理组分泌的TGF-β少于对照组。然后，为了确定二甲双胍是否影响TGF-β信号分子，在二甲双胍存在下向PSCs施用重组TGF-β，发现二甲双胍降低了MMP2、磷酸化Smad 2/3和α-SMA的表达，它们与转移中的TGF-β信号传导有关。在二甲双胍处理的 PSCs 中，给予重组 TGF-β 逆转了 p-Smad2/3、α-SMA 和 MMP2 的衰减。此外进行了迁移测定，以确定二甲双胍的抗迁移作用是否独立于AMPK途径，结果表明，二甲双胍的抗迁移作用与AMPK依赖性途径无关，二甲双胍是通过TGF-β而非AMPK信号通路减弱PSCs的迁移能力

为了研究二甲双胍如何影响人PDAC类器官，从术后组织中分离和培养了类器官，并观察48小时（图2 A），用EhtD-1和钙黄绿素AM染色以评估细胞活力，发现对照组和二甲双胍组没有显著差异（图2 B）。细胞毒性和细胞增殖测定也未显示差异（图2 C）。然后研究了二甲双胍是否会降低参与癌症侵袭性相关的癌症干细胞（CSC）标志物，发现癌症干性标志物LGR5、CD24、CD44、CD133和EpCAM的mRNA转录本在N0期PDAC类器官中显著降低（图2 D）。在 N1 和 N2 期 PDAC 类器官中，LGR5 显著降低（图2 E、F）。在N0-N2期 PDAC 类器官中，CD24、CD44和EpCAM降低（图2 D-F）。此外，二甲双胍处理显著降低了CSC标志物的蛋白表达水平（图2 G）。这些结果表明，二甲双胍诱导PDAC类器官中癌症干性标志物的下调，而不影响细胞活力或增殖。

图2 二甲双胍抑制PDAC类器官肿瘤干性标志物的表达。

进一步地，为了概括人PDAC基质的肿瘤微环境，利用PDAC类器官和PSCs建立了体外3D直接共培养模型（图3 A），PSCs包围了PDAC类器官，而没有干扰PDAC类器官的导管结构（图3 B）。然后比较了有和没有二甲双胍处理的癌症干性因子的mRNA转录水平。二甲双胍在3D直接共培养模型中减弱了CD24、CD44、CD133和LGR5的基因和蛋白表达水平（图3 C、D），这些发现在N1期和N2期PDAC类器官和PSCs中是一致的，表明PDAC类器官和PSCs的共同培养可以模拟人PDAC基质而不破坏导管结构，而且二甲双胍可以作为辅助治疗以减少癌症干性因子。

图3 在基质胶中PDAC类器官和PSCs的体外3D直接共培养。

此外，使用间接共培养系统检查了二甲双胍对PDAC 类器官和 PSCs 中癌症侵袭和迁移标志物基因表达的影响。结果表明，二甲双胍降低了上室PSCs中MMP2和TIMP2的基因表达，以及下室PDAC类器官中癌症干性标志物CD24、CD44、CD133和LGR5 的表达。

然后，研究了MMP2在二甲双胍对PSCs的抗迁移作用中的影响，使用间接共培养系统评估了向底部孔迁移的PSCs数量（图4 A）。为了探究MMP2下调在二甲双胍抗迁移作用中的影响，分别用MMP2 siRNA或对照siRNA转染PSCs，并使用间接3D共培养系统进行迁移测定。结果证实，用MMP2 siRNA转染可显著降低PSCs中MMP2的mRNA表达（图4 B）。然后研究MMP2沉默的PSCs的迁移能力，发现MMP2沉默组向孔底迁移的PSCs数量明显少于对照组（图4 C、D）。在对照和MMP2沉默组中，二甲双胍处理显示出与单独使用MMP2沉默组相同的结果（图4 C、D）。此外，为了探索MMP2是否可以促进PSCs的迁移和侵袭能力，在培养基中添加了rhMMP2。与对照组相比，rhMMP2处理导致更增强的迁移能力。在rhMMP2组中，二甲双胍处理与对照组一样减弱了增强的迁移（图4 C、D）。这些结果表明，二甲双胍通过靶向MMP2对PSCs发挥抗迁移作用。

图4 体外3D迁移模型中MMP2敲低对PSC迁移能力的影响。

最后，研究了临床相应剂量的抗高血糖药物二甲双胍是否会影响裸鼠皮下植入PDAC类器官的肿瘤生长，对异种移植小鼠以每天30 mg/kg口服二甲双胍，持续28天，对照组注射无菌水。结果表明，二甲双胍的给药明显减小了肿瘤体积。此外，二甲双胍组的平均肿瘤重量明显低于对照组，而且二甲双胍组异种移植肿瘤的大小在视觉上小于对照组。二甲双胍给药28天后，癌症干性和增殖标志物，如CD24、CD44、CD133和Ki67的mRNA水平显著降低。这些数据表明，二甲双胍抑制PDAC肿瘤异种移植物在体内的生长。

总之，二甲双胍的抗癌作用可在使用患者来源的PDAC类器官和人原代PSCs制成的PDAC的3D直接和间接共培养模型中得到证实。此外，在异种移植模型中观察到二甲双胍的抗癌作用。该研究结果表明，二甲双胍对PSCs的抗迁移作用的关键机制是通过MMP2下调发生的，这与TGF-β信号的下调有关；二甲双胍处理还可以减弱单独培养或与 PSCs 共培养的 PDAC 类器官的癌症干性。这种抗癌作用是可以通过使用与2型糖尿病患者相当剂量的临床相关的二甲双胍浓度来实现的。

参考文献：Hahn S, Oh BJ, Kim H, Han IW, Shin SH, Kim G, Jin SM, Kim JH. Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma. Am J Cancer Res. 2023 May 15;13(5):1806-1825. PMID: 37293149; PMCID: PMC10244103.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37293149/

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