Gsmtx4在过度机械应变下通过Piezo1/Calcineurin/NFAT1 信号轴缓解骨关节炎

骨关节炎（OA）是最常见的慢性关节疾病，以关节软骨的退行性变化和消失为特征。年龄、肥胖、代谢以及遗传因素已被证明与OA的发生有关。过度的机械应变是OA发生的必要因素，包括拉伸、剪切和应变。在肥胖、创伤和关节不稳定等病理条件下，软骨细胞对过度的机械应变作出反应，表现为细胞凋亡和炎症反应，从而加速OA的进展。

机械敏感离子通道是细胞表面将机械力学刺激转化为细胞内电信号或化学信号的机械感受器。压电型机械敏感离子通道组件1（Piezo1）在生长板软骨细胞中发挥作用，并有助于发育过程中的软骨形成和软骨内骨化。此外，Piezo1对异常的机械刺激作出反应，导致软骨细胞凋亡和衰老。然而，Piezo1在过度机械应变诱导的OA中的潜在作用和机制尚不清楚。

钙是真核细胞中必不可少的第二信使，调控各种生理和生化过程，如合成代谢、表型维持和细胞凋亡。在OA软骨中观察到高钙含量并引起软骨基质降解。钙调磷酸酶（Calcineurin，CaN）-活化T细胞（NFAT）核因子信号轴的是钙下游的关键信号。CaN是一种对钙浓度敏感的磷酸酶，可使高度磷酸化的NFAT因子去磷酸化并导致其核易位。激活的NFAT1有助于基质金属酶和炎性细胞因子的表达，从而触发OA。鉴于Piezo1响应机械应变传递钙，因此推测机械应变通过Piezo1 / CaN / NFAT1信号轴加重OA。

Gsmtx4是一种从狼蛛毒液中分离出来的肽，可以抑制Piezo1的活化。Gsmtx4在治疗心肌梗死、遗传性球形红细胞增多症和高血压等多种疾病中的有益应用已有大量证据。因此，通过Gsmtx4靶向Piezo1 / CaN / NFAT1信号轴对OA具有广阔的治疗潜力。

最近，在武汉大学人民医院骨外科、中南医院关节与运动医学科的一项研究中，阐明了过度机械应变加重OA的潜在机制，研究结果表明，Piezo1是软骨细胞中响应机械信号的基本分子，并通过CaN / NFAT1信号轴调节细胞凋亡和软骨基质代谢，并且Gsmtx4可能是针对OA治疗的有吸引力的药物。相关内容发表在 International Journal of Molecular Sciences 题为“Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain”。

首先，为了确定Piezo1在OA软骨中的表达，实验收集了OA患者的关节软骨组织，并在损伤或完整区域评估了Piezo1的表达，观察到关节软骨损伤区与完整区相比有明显的软骨退变（图1 a）。免疫组织化学分析显示，损伤区Piezo1蛋白水平较完整区升高（图1 b）。类似的，发现Piezo1在手术诱导的OA大鼠关节软骨中明显上调（图1 c、d）。

然后，从未成熟大鼠中分离软骨细胞，以探索Piezo1在体外OA模型中的表达。过度的机械应变是OA发展的关键致病机制。因此，在体外张力系统中培养软骨细胞，以模拟OA进展中经历的过度机械应变。结果显示，暴露于循环机械应变（1 Hz，20%）的软骨细胞中，Piezo1的mRNA和蛋白水平以时间依赖性方式增加（图1 e-g）。因此，可能是由于机械应变， Piezo1 的水平在 OA 的关节软骨中上调，特别是在损伤区域。

图1 Piezo1在OA患者和大鼠的关节软骨中上调

接下来，实验确定了Piezo1在机械应变信号转导中的作用。明场图像显示，软骨细胞的形态从多边形变为纺锤形，并且在暴露于12小时的机械应变后出现凋亡小体。此外，机械应变以时间依赖性方式导致软骨细胞凋亡以及合成代谢和分解代谢失衡。鉴于机械应变对软骨细胞的影响在24 小时达到阈值，因此在后面的实验中使用24 小时的机械应变。

Piezo1是感知软骨细胞表面机械信号的关键蛋白。因此，si-Piezo1 在软骨细胞上施用以确定 Piezo1 在机械信号转导中的作用。结果表明，si-Piezo1可以降低Piezo1的mRNA水平。实验发现，si-Piezo1 逆转了机械应变引起的凋亡细胞比例的增加并改变了凋亡相关分子如BCL2相关X蛋白（BAX）和B细胞淋巴瘤/白血病-2 （BCL2）的表达。此外，si-Piezo1重新平衡了受机械应变破坏的软骨基质合成代谢和分解代谢。

为了进一步确认Piezo1在机械信号传导中的作用，用Yoda1处理软骨细胞，Yoda1是一种有助于激活Piezo1的合成化合物。结果发现，Yoda1处理的效果与机械应变相似，呈现高比例的凋亡细胞，BAX，BCL2，MMP3，MMP13，COL2A1和聚集蛋白聚糖的表达改变。此外，si-Piezo1 可以减轻其对细胞凋亡或合成代谢/分解代谢失衡的影响。这些数据表明，机械应变通过上调和激活Piezo1诱导软骨细胞凋亡和合成代谢/分解代谢失衡。

Piezo1激活后，细胞质中的钙通过钙内流增加。因此，实验专注于钙信号传导的主要下游途径，CaN/NFAT信号传导轴，以阐明Piezo1诱导软骨细胞凋亡和合成代谢/分解代谢失衡的机制。结果表明，si-Piezo1抑制了机械应变引起的钙内流和CaN的激活（图2 a、b）。免疫荧光和蛋白质印迹结果表明，si-Piezo1逆转了机械应变促进的NFAT1核易位（图2 c、d）。接下来，在软骨细胞上应用Yoda1，以进一步探索Piezo1对CaN / NFAT1信号轴的影响。与机械应变类似，Yoda1对钙内流、CaN活性和NFAT1的核易位有积极影响，并被si-Piezo1逆转（图2 e-g）。这些数据表明，机械应变通过上调和激活Piezo1表达来激活CaN / NFAT1信号轴。

图2 机械应变下的Piezo1激活CaN/NFAT1信号轴。

然后，为了评估Piezo1/CaN/NFAT1信号轴在机械信号转导上的必要性，使用Gsmtx4、CaN抑制剂CsA和NFAT抑制剂VIVIT peptide 特异性阻断CaN/NFAT1信号传导轴的信号转导。结果表明，Gsmtx4降低了细胞内钙浓度，但几乎不受CsA和VIVIT peptide的影响。同时，CsA和Gsmtx4都可以使机械应变处理的软骨细胞中CaN失活。免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，Gsmtx4、CsA和VIVIT抑制NFAT1的核易位。最后，发现Gsmtx4，CsA和VIVIT可以保护软骨细胞免受细胞凋亡以及合成代谢和分解代谢失衡。因此，Piezo1/CaN/NFAT1信号轴对于机械信号转导是必需的，阻断Piezo1/CaN/NFAT1信号轴可以保护软骨细胞免受机械应变下的凋亡和合成代谢/分解代谢失衡。

最后，研究人员试图研究通过关节内注射Gsmtx4阻断Piezo1 / CaN / NFAT1信号轴对ACLT-诱导的OA大鼠的影响。实验以两种不同的频率进行注射（H-Gsmtx4组每周一次，L-Gsmtx4组每两周一次）（图3 a）。结果显示，术后8周ACLT组关节软骨表面糜烂和蛋白聚糖丢失。与ACLT组相比，ACLT+L-Gsmtx4组和ACLT+H-Gsmtx4组关节软骨破坏程度较轻，尤其是后者（图3 b）。与ACLT组相比，Gsmtx4处理组的OARSI评分明显较低，ACLT+H-Gsmtx4组低于ACLT+L-Gsmtx4组。此外，Gsmtx4降低了软骨细胞的凋亡比例，且呈剂量依赖性（图3 c）。免疫组织化学染色结果显示，Gsmtx4注射降低了ACLT诱导OA模型中MMP3和MMP13的表达，增加了COL2A1和聚集蛋白聚糖的表达（图3 d）。其中，高频率关节内注射Gsmtx4表现出较好的疗效。这些数据表明，Gsmtx4可以通过抑制细胞凋亡和合成代谢/分解代谢失衡来改善大鼠的OA。

图3 大鼠关节内注射Gsmtx4可改善OA。

图4 Gsmtx4在过度机械应变下缓解OA的分子机制示意图。

总之，该研究证明了Piezo1在机械应变下上调和激活，并通过CaN / NFAT1信号轴引起软骨细胞凋亡和合成代谢/分解代谢失衡。Piezo1抑制剂Gsmtx4在体内和体外均可缓解OA。结果支持Piezo1 / CaN / NFAT1可能是OA的有希望的治疗靶点。

参考文献：Ren X, Zhuang H, Li B, Jiang F, Zhang Y, Zhou P. Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4022. doi: 10.3390/ijms24044022. PMID: 36835440; PMCID: PMC9961447.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36835440/

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