胰腺癌细胞中的机械应力信号触发p38 MAPK和JNK依赖性细胞骨架重塑，并通过Rac1 / cdc42 / 肌球蛋白II促进细胞迁移

胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺癌病例的 90% 以上，PDAC的特征是预后极差。目前的研究重点是使PDACs的微环境正常化。PDAC微环境的特征是由细胞外蛋白（如胶原蛋白I和透明质酸）组成的致密肿瘤相关基质，这些蛋白被重塑以产生僵硬的细胞外基质，这种情况称为纤维增生。

氯沙坦通过其转化生长因子β（TGFβ）抑制活性，已在临床上作为靶向致密基质的方法进行了测试。基质硬度增加也可作为诊断标志物，与预后不良有关。它可以激活黏着斑蛋白，如局部黏着斑激酶（FAK）和桩蛋白，以及肌动蛋白细胞骨架重塑蛋白，如RAC，RHO GTPase/Rho相关激酶（ROCK）和RAS GTPases，以触发诱导细胞运动，迁移和侵袭的信号级联。此外，在物理受限环境中的肿瘤生长也导致肿瘤内部机械压缩力的发展，导致肿瘤内压缩应力可达到75 mmHg（10 kPa）。这种类型的机械应力已被证明可以激活促进肿瘤发生和侵袭性的信号通路。

塞浦路斯大学癌症生物物理学实验室、美国匹兹堡大学生物工程系、俄勒冈健康与科学大学奈特癌症研究所等研究团队的人员假设机械应力激活了在胰腺肿瘤中被持续激活的信号通路。这些通路包括参与细胞存活和运动调节的PI3K/AKT和RAS/MAPK信号级联。RAS/MAPK信号通路的增加可能是由于K-Ras是侵袭性胰腺肿瘤中最常见的突变基因。K-Ras可以激活PI3K / AKT通路，但其主要靶点是MAPK信号级联反应，包括c-Jun N端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。在该团队以前的研究中，发现机械应力通过激活胰腺癌和脑癌细胞系中的P13K / AKT和MEK1 / ERK1信号级联来促进生长分化因子15（GDF15）诱导的癌细胞迁移。在这些发现的基础上，他们又使用蛋白质组学测定来鉴定机械应力诱导的信号级联反应，这可能有助于胰腺癌细胞的运动。研究结果阐明了机械应力诱导的信号传导机制，并确定限制胰腺癌细胞迁移的治疗靶点。

蛋白质组学分析揭示了跨多个通路的异质反应，并揭示了p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun作为胰腺癌细胞中机械应力诱导的信号通路的激活

为了研究胰腺癌细胞中机械应力诱导的信号通路，实验分析了在胰腺癌细胞上施加压缩力后的总蛋白和磷酸化蛋白水平。使用胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和PANC-1（携带KRAS突变），将 MIA PaCa-2 细胞置于压力装置下施加4.0 mmHg的压缩力。

对照细胞和压缩细胞之间倍数变化最大（20%）的蛋白质增加（红色）或减少（蓝色）在热图中可视化（图1 A）。研究发现，机械应力激活了许多调节因子，介导细胞适应多种应激信号，包括热休克应激、内质网应激、炎症应激和氧化应激。具体而言，细胞应激反应介质，热休克蛋白27（HSP27_pS82）及其上游激活剂 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK_pT180_Y182）在压缩细胞中表现出与对照细胞相比的强激活，这也通过免疫印迹在 MIA PaCa-2 和 PANC-1 细胞中得到验证（图1 B、C、C、E、H）。根据p38 MAPK的激活，发现应激反应蛋白c-Jun JNK的下游靶点c-Jun（pS73）也在压缩细胞中被激活。随后通过免疫印迹验证c-Jun和JNK的激活（图1 F-H）。细胞应激的其他标志物，包括微管相关蛋白1A/1B 轻链3B（LC3）A-B（自噬体标志物）和内质网 （ER）应激传感器伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）-葡萄糖调节蛋白（GRP78）（也称为 HSP70），也因受到压缩力而升高（图1 A）。

在前10种上调蛋白中，观察到与肌动蛋白细胞骨架组织和细胞收缩有关的纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的强烈上调。PAI-1的作用由肌球蛋白II的下游激活介导，它与肌动蛋白丝相互作用形成肌动球蛋白，允许细胞收缩，从而使细胞运动和侵袭。事实上，肌球蛋白II也在压缩细胞中被激活，如图1 A。这些介质的表达和磷酸化的增加可能有助于在机械压缩下增强细胞的迁移。

另一方面，机械应力下调了哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）通路的多个靶点，包括p70-S6K_pT389、Rictor_pT1135、4E-BP1_pS65和mTOR_pS2448，它们促进蛋白质合成和细胞生长增殖（图1 A）。为了评估机械应力如何改变信号通路，计算了九个主要通路的通路评分，发现细胞周期通路的多个蛋白质成员（p27_pT157，细胞周期蛋白E1、B1、D1）和结节性硬化症复合体（TSC）/mTOR通路减少。相比之下，PI3K/Akt和Ras/MAPK信号通路的蛋白质成员升高（图1 F）。

总的来说，结果表明，机械应力激活细胞应激反应介质和肌动蛋白细胞骨架调节因子，这可能触发细胞运动并损害细胞周期进程和增殖。

图1 进行RPPA实验以揭示胰腺癌细胞系中机械应力诱导的机制。

机械应力诱导肌动蛋白细胞骨架重塑和胰腺癌细胞收缩，促进其迁移能力

接下来评估压缩下MIA PaCa-2和PANC-1胰腺癌细胞系中肌动蛋白细胞骨架组织的变化。实验观察到，压缩的MIA PaCa-2和PANC-1（图2 A、B）与未压缩的细胞相比，应力纤维、丝状伪足和片状伪足形成增加。同时，压缩细胞的圆度降低，纵横比增加。此外，发现压缩的MIA PaCa-2和PANC-1细胞中的磷酸肌球蛋白II水平增加。压缩细胞中磷酸肌球蛋白II也与肌动蛋白丝共定位（图2 C、D），提示肌动球蛋白收缩力增加。

为了评估细胞骨架的这些变化是否促进机械应力下的细胞运动，进行了划伤试验，发现与未压缩的细胞相比，压缩的PANC-1细胞表现出更高的迁移能力（图2 E、F）。基于细胞形状细长和迁移增加的结果，用qPCR分析了上皮-间充质转化（EMT）基因SNAIL、SLUG和TWIST的表达。这些基因在两种细胞系中均上调，进一步验证了压缩细胞的运动性增强（图2 G）。

最后，实验还检查了Rac1和cdc42 GTPases的激活，它们通过诱导肌球蛋白II活化来调节肌动蛋白细胞骨架组织以形成细胞突起和肌动球蛋白收缩力。事实上，G-LISA表明，Rac家族小GTPase1（Rac1）早在细胞暴露于压缩后30分钟就被激活，而细胞分裂周期因子42（cdc42）GTPase在16小时被激活（图2 H），这表明可能是机械应力诱导的 Rac1/cdc42/肌球蛋白 II 轴的激活。同时，细胞活力试验和Ki67免疫染色增殖试验显示，在压缩后至少16小时内，与对照MIA PaCa-2和PANC-1细胞相比，压缩后的细胞没有显著变化。但压缩后48小时细胞增殖减少。

总之，结果表明，在细胞适应的前16小时内，机械应力通过Rac1 / cdc42 / 肌球蛋白II轴和基因表达改变诱导肌动蛋白细胞骨架的变化以触发细胞迁移。

图2 机械应力诱导胰腺癌细胞的细胞骨架变化和细胞收缩，促进其迁移能力。

p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun通路是胰腺癌细胞在机械应力下迁移所必需的

为了评估应激反应通路p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun的激活是否在机械应力下细胞迁移潜力的增加中起作用，实验用p38 MAPK（SB202190）或JNK（SB202190）抑制剂处理MIA PaCa-2和PANC-1细胞。接下来进行了划痕试验，观察到当用任何一种抑制剂在加压下处理时，MIA PaCa-2和PANC-1癌细胞的迁移显著减少（图3 A-C），而当用相同浓度（15 μmol/L）的任一抑制剂处理未压缩细胞时，未观察到任何效果。Ki67染色显示细胞增殖也被有效抑制（图3 D、E）。为了进一步证实结果，用siRNA处理p38 MAPK alpha 和JNK1/2的细胞，对siRNA处理的对照和压缩细胞进行了划痕测定。实验观察到，与各自的未压缩细胞相比，只有用sip38 MAPK或 siJNK1/2处理的压缩细胞的迁移能力下降。与细胞迁移的减少和EMT标志物的表达一致，用任一抑制剂处理的压缩细胞中的肌动蛋白细胞骨架染色显示细胞突起减少以及应力纤维形成。细胞形态的定量表明，用任何一种抑制剂处理细胞时，细胞长宽比降低，细胞圆度增加。

总的来说，结果表明，机械应力可以导致p38 MAPK和JNK信号通路的激活，这些通路是肌动蛋白细胞骨架重塑和癌细胞迁移所必需的，也是维持压缩细胞增殖所必需的。

图3 p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun通路对于机械应力下胰腺癌细胞的增殖和迁移都是必需的。

Rac1-和cdc42-GTPases介导机械应力诱导的细胞骨架变化，促进胰腺癌细胞迁移

因为机械应力会诱发细胞突起、丝状伪足和片状伪足（图2 A、B），并且由于这些结构受RAC1和cdc42小GTPases 的调节，实验用针对RAC1和CDC42的siRNA处理MIA PaCa-2和PANC-1细胞，并进行划痕愈合实验和鬼笔环肽染色，以检查它们在介导压缩效应中的作用。确认这些基因的成功敲低（图4 A、B），观察到siRac1处理的细胞对伤口闭合的强烈抑制，而在sicdc42处理的细胞中作用较弱（图4 C-E）。此外，肌动蛋白应激纤维、丝状伪足和片状伪足形成减少，细胞纵横比减少，细胞圆度增加。同时还发现，尽管肌球蛋白II在siRNA处理的压缩细胞中被激活，但肌动球蛋白的形成减少。

为了确定RAC1和CDC42下调与JNK或p38 MAPK激活之间的相互作用，进行了免疫印迹，发现JNK和p38 MAPK激活在RAC1或CDC42敲低后不受影响。此外，用siRac1或sicdc42处理不影响MIA PaCa-2或PANC-1细胞的增殖（图4 F）。

总的来说，结果表明，p38 MAPK和JNK在机械应力下的激活，维持细胞活力，并不依赖于Rac1和cdc42 GTPases，而这些GTPases 是肌动蛋白细胞骨架重组和细胞运动所必需的。

图4 Rac-1-和cdc42-小GTP酶介导机械应激诱导的胰腺癌细胞迁移。

图5 图形概要

机械应力诱导的信号通路，驱动胰腺癌细胞迁移。在宿主组织的受限环境中，胰腺肿瘤生长过程中会产生机械压缩力。这些力通过激活JNK / c-Jun，p38 MAPK / HSP27，Rac1和cdc42在细胞内传递各自的固体应力。p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun信号轴的激活可以通过驱动细胞在压缩下的增殖来调节细胞对新环境的适应。Rac1和cdc42依次被激活，并且可以调节肌动蛋白细胞骨架重塑，以形成逐渐改变细胞形状的细胞突起。Rac1和cdc42也介导肌动球蛋白收缩性，最终在压缩下促进胰腺癌细胞迁移。

总的来说，该研究结果建立了一种新的机制，通过激活p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun信号轴以及肌动蛋白细胞骨架重塑因子Rac1，cdc42和肌球蛋白II 来促进肿瘤进展。研究结果强调，靶向适应机械肿瘤微环境的肿瘤细胞中的异常信号是一种阻止肿瘤迁移的新方法。

参考文献：Kalli M, Li R, Mills GB, Stylianopoulos T, Zervantonakis IK. Mechanical Stress Signaling in Pancreatic Cancer Cells Triggers p38 MAPK- and JNK-Dependent Cytoskeleton Remodeling and Promotes Cell Migration via Rac1/cdc42/Myosin II. Mol Cancer Res. 2022 Mar 1;20(3):485-497. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-21-0266. PMID: 34782370; PMCID: PMC8898300.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34782370/

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