使用三维类器官-成纤维细胞共培养系统对胰腺癌基质介导的化学耐药性进行患者特异性建模

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，化学耐药性是导致胰腺癌患者预后不良的主要因素。全身化疗是控制疾病的主要治疗手段，但是传统的单药或联合化疗方案均未显示出令人满意的疗效。PDAC肿瘤微环境主要由细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、浸润免疫细胞和脉管系统组成，通过多种尚未完全阐明的机制在驱动肿瘤化学耐药性方面起着至关重要的作用。CAFs 对作为胰腺导管腺癌一线用药的吉西他滨具有天然抗性，其中涉及多种机制，例如诱导肿瘤细胞中的抗凋亡/促存活通路、改变肿瘤吉西他滨的代谢和释放外泌体等。

忽视肿瘤-基质相互作用的次优肿瘤建模（Suboptimal tumor modeling）被认为是临床前高药物损耗率的重要因素。因此，迫切需要将基质成分纳入药物筛选模型。PDAC肿瘤类器官近年来作为3D体外疾病模型出现，能够保留原始肿瘤的内在异质性和遗传改变。然而，基于纯上皮类器官培养模型的药物筛选未能考虑患者特异性肿瘤微环境的参与。因此，将相关基质成分掺入类器官培养物是优化肿瘤组织建模和药物反应预测的关键一步。

异细胞类器官培养有助于掌握CAF异质性并剖析复杂的肿瘤-基质相互作用。例如，使用小鼠类器官共培养系统鉴定出两种不同但具有可塑性的CAF亚型，即myCAFs 和 iCAFs。Tsai团队建立了包括CAFs和T细胞在内的PDAC类器官的培养，进一步证明了这些模型适用于研究PDAC肿瘤微环境。然而，使用匹配的3D异型类器官培养物进行个性化药物筛选分析尚未报道。

2022年10月，来自德国海德堡大学医院欧洲胰腺中心、柏林夏里特医学院及奥地利维也纳医科大学普外科等团队在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 杂志发表了题为“Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system” 的文章。该研究建立了患者来源的PDAC类器官（PDOs）和患者匹配的CAFs的直接3D共培养模型，使用基于实时图像的药物测定DeathPro，探讨了CAFs对一线化疗药物吉西他滨，5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的PDO化疗敏感性的影响，并在单细胞水平上阐明了肿瘤-基质相互作用诱导的转录变化。

首先，建立了5对患者匹配的PDAC肿瘤类器官（PDAC-PDOs）和CAFs直接的3D共培养模型。证据表明，CAFs在3D培养模型中促进肿瘤细胞的增殖，在5个匹配的共培养物中有4个观察到CAFs对PDAC类器官增殖的增强作用。

接下来，在PDO单培养和PDO/CAF共培养中，评估PDOs对临床治疗中常用的三种化疗药物，即吉西他滨、5-FU和紫杉醇的敏感性。

通过DeathPro、Hoechst和propidium iodide染色等方法，实验观察到响应曲线的细胞死亡和增殖抑制参数的强相关性。在没有药物治疗的对照条件下，CAFs对类器官增殖的增强作用导致共培养中类器官的相对生长比单培养平均增加1.3倍。对照条件下，类器官中细胞死亡的基础水平在单培养和共培养之间没有显著差异。

吉西他滨、5-FU和紫杉醇处理诱导的细胞死亡在PDO单培养中显著高于PDO/CAF共培养（图1 A、B）。在共培养条件下，平均死亡值显著降低，表明CAFs的存在导致类器官对化疗的细胞毒性作用的抗性增加。然而，这种影响的程度是患者和药物特异性的，提示肿瘤-基质相互作用对化疗耐药机制的影响存在异质性。共培养中的PDOs也显示出吉西他滨诱导的增殖抑制降低（图1 C、D）。5-FU仅观察到最大值显著的下降。紫杉醇处理后，在CAFs存在下，类器官增殖抑制没有显著差异（图 1 C、D）。值得注意的是，紫杉醇在抑制类器官增殖方面不如吉西他滨或5-FU（图1 C）。

这些数据表明，CAFs对吉西他滨，5-FU和紫杉醇对PDAC-PDOs的细胞毒性作用具有保护效应，直接促进了肿瘤细胞耐药性，进一步强调了异型培养模型与个性化体外药物检测的相关性。

图1 类器官与匹配的CAFs共培养时药物敏感性降低。
（A、B）与CAFs共培养时，吉西他滨、5-FU和紫杉醇诱导的PDAC类器官的细胞死亡显著降低。（C、D ）吉西他滨诱导的PDAC类器官中的增殖抑制在共培养中显著降低（AUCpi, max. PI）。对于5-FU，max 明显较低。在共培养中观察PDAC类器官的PI（增殖抑制）。

然后，为了深入了解CAFs触发的PDAC类器官化疗耐药性增加的机制，实验进行了scRNA-seq以鉴定PDO/CAF共培养中诱导的转录变化，在3D单培养和共培养5天后对3株类器官和患者匹配的CAFs进行单细胞测序（图2 A）。类器官细胞通过肿瘤标志物KRT18和KRT19的表达进行鉴定，而CAFs通过DCN和LUM表达来鉴定（图2 B）。实验观察到，类器官和CAF群体的患者特异性聚类，表明单体样本之间的转录异质性（图2 B）。

所有测序的CAFs聚类可以区分出7个转录簇（图2 C、D），它们具有不同的功能特征。在共培养中，观察到第5簇的CAFs的比例增加（图2 E），其特征在于与细胞周期相关的基因表达较高，表明共培养中CAFs的增殖可能增加。另一方面，与炎症、运动和TNF-α信号传导相关的第1簇的比例在共培养中降低（图2 E），尽管这仅限于单个样本（112）水平的情况。然而，由于CAFs亚型之间的解离效率可能存在差异，这些数据的比例可能无法完全反映培养物中的细胞数量。

而且与单独培养CAFs相比，共培养的CAFs集群也呈现差异化表达。在iCAF和myCAF两种不同的转录簇分析中，88.5% 的CAF群体对应于myCAFs（6509个细胞），而11.5% 被归类为iCAFs（847个细胞）。iCAFs几乎完全对应于炎症相关的簇1（图2 F）。iCAF标记基因在共培养环境中的表达水平高于单培养（图2 G）。

通过对所有细胞簇中差异表达基因的基因集富集分析，进一步比较了单培养和共培养中的CAFs。共培养中两个显著富集的基因集与增殖有关（图2 H）。在共培养中富集最高的基因集中，发现了与炎症相关的标志性基因集（图2 H、I）。

这些数据表明，与PDAC类器官共培养诱导CAFs中的促炎表型，这可能驱动肿瘤细胞中增强的化疗耐药性，并且可能提供治疗分子靶点。

图2 与PDAC类器官共培养后，CAFs中的炎症途径表达上调。
（A）用于单细胞RNA测序的样本概述。（B）所有单细胞转录组的 UMAP 表示。虚线表示CAF和PDAC细胞。（C）来自单独培养和共培养样本的CAFs的综合UMAP表示，其中7个聚类。（D）C中每个 CAF 簇的前五个富集基因的单细胞表达。（E）CAFs在单培养和共培养中7个簇中的分布。（F）iCAF样和myCAF样细胞的分布。（G）在F中鉴定的 iCAF 样和 myCAF 样群体中 iCAF 和 myCAF 标记基因的表达，比较单培养（蓝色）和共培养（红色）。与单培养相比，共培养中CAF中选定的Hallmark（H）和Reactome（R）通路上调。（I）在单培养（蓝色）和共培养（红色）中， CAF 中 TGFβ、IFN 和 TNFα 信号通路相关基因的表达，显示共培养条件下表达增加。

所有测序的PDAC-PDO细胞中鉴定了8个转录簇。每个簇的比例在类器官系之间不同，反映了患者特异性转录异质性。有趣的是，与单一培养相比，没有观察到共培养中PDAC类器官细胞的任何已鉴定转录簇的增殖评分有显著变化。

最后，通过在单细胞水平上对每个亚型基因特征的表达进行评分，进一步根据PDAC中的两种主要转录亚型（即经典亚型和基底样亚型）来表征PDO细胞。在单培养和共培养条件下未观察到亚型评分的显著差异，表明CAFs的存在不会在模型中诱导肿瘤细胞亚型状态的转变。

为了评估与CAFs共培养诱导的转录变化，分析了PDAC类器官细胞在单培养和共培养条件下的差异表达基因。与上皮-间充质转化相关的几个基因，如COL1A1，COL1A2，FN1，LAMC2和VIM在共培养的类器官细胞中上调。此外，还发现与炎症相关的基因集在与CAFs共培养的类器官细胞中富集。

进一步关注已鉴定的PDAC细胞转录簇的EMT标记，发现在共培养条件下几乎所有簇的EMT表达评分都有所增加。几个单独的EMT相关基因的表达在共培养中也上调。通过结合Cell Phone DB（配体-受体相互作用的开放库），检测到PDO细胞（受体）和CAFs（配体）之间潜在的细胞间受体-配体相互作用。此外，在PDAC类器官细胞和CAFs之间鉴定出与EMT相关的几种受体-配体相互作用，如CD44-HGF，CD44-LGALS9或CD44-FGF2。通过免疫荧光染色，可以在原始组织中确认受体-配体相互作用对CD44-HGF的空间接近和共定位，支持了共培养模型中发生的肿瘤-基质相互作用的体内相关性。

这些数据表明，CAFs和上皮癌细胞之间的细胞间相互作用在共培养系统中得以复制，导致PDAC类器官细胞中EMT的上调和化学抗性增加。

总之，该研究表明，PDAC类器官在与患者匹配的CAFs共培养中的化疗耐药性增加，强调了复杂共培养模型与个性化医疗应用的相关性。这也为以患者特异性方式研究靶向肿瘤微环境的药物的功效和作用方式提供了可能性。因此，这项研究为在高通量可接受的3D培养环境中模拟患者特异性肿瘤-基质相互作用以进行相关发现和药物测试提供了可行性的证据。

参考文献：Schuth S, Le Blanc S, Krieger TG, Jabs J, Schenk M, Giese NA, Büchler MW, Eils R, Conrad C, Strobel O. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Oct 22;41(1):312. doi: 10.1186/s13046-022-02519-7. PMID: 36273171; PMCID: PMC9588250.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36273171/

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