剪切力|切应力|细胞流体剪切力|fluid shear stress|仿血流剪切应力培养系统

血流动力学因素在动脉粥样硬化、血栓形成和动脉瘤等血管疾病的发生中起关键作用。其中，扰动剪切应力（SS）被认为是血管疾病发生和进展的主要生物力学因素之一。除了生物力学外，包括转化生长因子β（TGFβ）/骨/体形态发生蛋白（BMP）信号轴的生长因子在内的扰动生化信号已被证明可以调节ECs 在EndoMT 中的转变。因此，受干扰的TGFβ/BMP信号和生物力学的结合有助于动脉粥样硬化和EC炎症的发病机制。

BMP9/10 是可溶性配体，在血流中循环作用于内皮细胞。它们通过与高亲和力I型受体活化素样激酶1（ALK1）和II型受体结合，并在共受体Enoglin的促进下，不断为EC提供存活和静止信号。通过典型的SMAD1/5转录因子信号调节靶基因是环境依赖性的，因为BMP9单独调节分化抑制剂（ID）基因的表达，或与其他因子（如TNF-α）、SELE或EDN1的表达联合使用。BMP信号失调驱动EC增殖、去分化和炎症基因特征。抗动脉粥样硬化性高 SS 与致动脉粥样硬化性低 SS 如何整合到 ALK1-Endoglin-SMAD1/5 信号轴的调节中，人们知之甚少。

BMP受体内吞作用通过不同的途径发生。网格蛋白（Clathrin）介导的内吞作用（CME）诱导SMAD信号转导，而小窝蛋白（Caveolin）介导的内吞作用（CvME）导致信号转导终止和受体降解。有研究提出了另一种模型，即在TGFβ I型受体的内吞作用中，CME和CvME都内化为早期内体抗原1（EEA-1）阳性早期内吞体（EEs）。重要的是，这些EEs是TGFβ-SMAD2/3信号的调控热点。

基于此，德国柏林自由大学生化研究所实验室及德国心血管研究中心（DZHK）科研团队的一项研究曾发现动脉粥样硬化保护性 HSS 可防止ALK1 和 Endoglin 在 Caveolin-1 阳性 EEs 中的积累，而致动脉粥样硬化LSS 则相反，实验确定它们是启动动脉粥样硬化性SMAD1/5信号传导的信号热点。此外，通过 siRNA 介导的敲低 Caveolin-1 导致 SMAD1/5 激活降低，这为如何在血管系统中靶向过度活跃的 BMP 信号转导提供了一种新模式。详细内容发表在 BMC Biology 期刊题为“Atheroprone fluid shear stress-regulated ALK1-Endoglin-SMAD signaling originates from early endosomes”。

致动脉粥样硬化流体剪切应力调控的ALK1-Endoglin-SMAD信号通路起源于早期内体

首先，实验使用RNAseq数据分析BMP受体和相关共受体的表达，发现ACVRL1 在 HSS（30 dyn/cm²）下上调，而大多数 BMP 和共受体在 LSS（1 dyn/cm²）下上调，包括 ALK1 共受体 Endoglin （ENG）。继续分析 Endoglin 的蛋白质水平，与 LSS 相比，HSS 中的 Endoglin 水平确实显著降低。

致动脉粥样硬化振荡SS（OSS）可诱导SMAD1/5的持续激活。虽然有研究指出，与LSS相比，OSS中SMAD1/5磷酸化的长期诱导与BMP配体无关，但最近的研究显示，在低血清条件下，短期层流SS介导的SMAD1/5磷酸化诱导依赖于BMP9/10。研究人员在这里表明，与HSS相比，长期（24h）应用LSS增加了SMAD1/5的磷酸化（图1 A）。因此，LSS 中的 BMP 靶基因转录高于 HSS（图1 B）。此外，观察到这种诱导依赖于ALK1配体，可能是BMP9和BMP10，因为用50 ng/mL ALK1-Fc（BMP9和BMP10的既定配体陷阱）处理可显著消除这种反应（图1 C）。BMP靶基因ID3以及炎症标志物EDN1、粘附分子P-选择素（SELP）和间充质标志物CDH2、ADAM12、NEXN和EndoMT介导的转录因子SLUG的表达在暴露于LSS并用ALK1-Fc处理的HUVECs中降低（图1 D）。值得注意的是，应用ALK1-Fc后，HSS中静脉EC标志物CD34和动脉粥样硬化保护性LDLR的表达降低（图1 D）。

这些数据表明，LSS暴露诱导SMAD1/5磷酸化以及随后EDN1，特别是间质基因的表达高度依赖于BMP9/10。然而，BMP-ALK1 信号协同 HSS 对于维持内皮表型的重要血管保护基因的表达至关重要。此外，还发现炎症和EC标志物（分别为ACE，CDH5和TEK）受SS而非BMP信号调节。这说明了BMP信号整合到SS介导的一组特定且重要的靶基因的转录变化中。

图1 HSS 和 LSS 对 ALK1 介导的 BMP 信号的不同影响。

先前的一项研究表明，在FSS下，Endoglin只需要促进BMP9 诱导的磷酸化-Smad1/5 信号，为了扩展这一研究，实验接下来探讨了短期（30min）FSS脉冲后，在低（0.2% FCS）和高（20% FCS）血清浓度下，Endoglin在BMP-SMAD对短时间FSS反应性中的作用。结果发现，pSMAD1/5 的急性血流诱导取决于施加的力的大小（HSS > LSS）和 Endoglin 的存在（图2 A）。然而，当不限制血清浓度的情况下进行相同的实验时，敲低Enoglin对SMAD1/5磷酸化没有显示出影响（图2 B），这表明只有在低血清（即BMP9/10的有限浓度）存在的情况下，Enoglin 才能整合对SMAD信号的急性FSS反应。

在存在 20% 血清和长期（24h）FSS 的情况下，发现 Endoglin 耗竭在 LSS 和 HSS 条件下显著增加磷酸化-SMAD1/5 水平（图2 C）。因此，可以得出结论，虽然Endoglin 在配体缺乏的血清条件下是FSS增强的BMP9/10信号所必需的，但在配体饱和的情况下则是可有可无的。此外，在 FSS 适应的 HUVECs 中，Endoglin 意外地限制了 BMP9/10-ALK1-磷酸化-SMAD1/5 的反应。这清楚地表明，Enoglin在ALK1或其配体受限的条件下尤为重要（例如遗传引发的ALK1或BMP9/10缺失导致的严重血管病变），而在EC适应血流时，它似乎对磷酸化-SMAD1/5信号通路起负调控作用。分析 ID3、EDN1 和 SLUG 的表达，发现它们在 HSS 和伴随的 Endoglin 敲低条件下表达增强（图2 D），表明 Endoglin 对血流适应的 ECs 具有保护作用。

为了进一步表征 Endoglin敲低的功能结果，对暴露于 HSS 的对照组或 Endoglin敲低组细胞进行了白细胞粘附测定。可以证明，在 Endoglin 敲低组显著更多的白细胞粘附在 HUVEC 单层上（图2 E、F）。这与敲低条件下 SELP 的增强表达一致（图2 G）。

然后，为了阐明 Endoglin 敲低后加剧的 SMAD1/5 磷酸化是否依赖于 BMP9/ALK1 信号传导，实验在 50 ng/mL ALK1-Fc 存在下进行了 Endoglin 敲低实验。结果发现，ALK1-Fc的添加有效地消除了SMAD1/5磷酸化，并将靶基因表达降低到对照水平以下（图2 C、D）。这些数据说明，Endoglin 对于保护 ECs 免于获得动脉粥样硬化表型是必要的，并且 Endoglin 缺失后 SMAD1/5 磷酸化的增加取决于 BMP9/10。

图2 Endoglin 根据血清浓度调节 FSS 诱导的 ALK1 介导的 BMP 信号。

目前，导致LSS诱导SMAD1/5磷酸化水平超过保护性HSS水平的分子机制仍然难以捉摸。有报道称，ALK5（一种I型TGFβ受体）通过Caveolin-1-和Clathrin-依赖性内吞作用被内化，并定位于Caveolin-1阳性EEs，并且这些内体富集了TGFβ通路的信号组分。有趣的是，ALK1 和 Endoglin 也被证明定位于 Cav-1 膜结构域。敲低 Caveolin-1 会降低 BMP9 诱导的 HUVECs 中 SMAD1/5 磷酸化。因此，研究人员假设 Caveolin-1 是血流诱导的 BMP9-Endoglin-ALK1 信号通路调控网络的一部分。

然后分析了长期应用HSS和LSS时Caveolin-1和Enoglin的分布，观察到大量富含 Endoglin 且 Caveolin-1 呈阳性的细胞内囊泡（图3 A、B），且暴露于LSS时的数量比HSS更多（图3 C）。Caveolin-1、Endoglin 和 EEA1 的共染色将这些囊泡鉴定为 EEs（图3 D、E），且LSS 中 EEA1 阳性 Cav-1 囊泡的发生率明显更高（图3 F）。

最后，实验分析了 Caveolin-1 阳性 EEs 中是否同时存在 Endoglin 和 ALK1，并对过表达的 ALK1-GFP 与内源性 Endoglin 进行了邻位连接测定（PLA），并对 Caveolin-1 进行了共染色。结果观察到 Caveolin-1 阳性囊泡内的 PLA 信号，表明 ALK1-Endoglin 受体复合物位于 EE 区室中（图3 G、H）。此外，与 Caveolin-1 共染色显示 Caveolin-1 囊泡中存在 SiR 标记的 BMP9（图3 I）。这清楚地表明，活跃的配体结合的受体信号复合物存在于富含Caveolin-1 的早期内体中。

这些数据表明，Endoglin 与 ALK1 和 BMP9 一起定位于富含 Caveolin-1 的 EEs，实验将其确定为一种新的但未被识别的信号区室，在长期暴露于 LSS 的ECs中促进 SMAD 积累。

图3 Caveolin-1阳性早期内体是 FSS 诱导的 BMP 信号转导的热点。

图4 图形概要。在动脉粥样硬化性LSS条件下（左），循环BMP9被在内皮细胞上表达的Endoglin隔离。Endoglin 与 II 型受体界面结合，从而阻断 BMP I/II 型受体复合物的形成。然而，残留的 BMP9-ALK1 型 II 受体信号发生在质膜上。通过小窝内化后，Endoglin 被 EEs 中的 II 型受体取代，并诱导加剧的 pSMAD1/5 信号传导，从而导致间充质和动脉粥样硬化蛋白基因的表达。在动脉粥样硬化保护性HSS条件下（右），BMP9与ALK1和II型受体以及Endoglin结合，后者抑制BMP9 I/II型受体的形成。与 LSS 相比，Caveolin介导的内吞作用显著减少，残留的 pSMAD1/5 信号来自质膜而不是 CAV1 EE。最终，HSS 导致负责 EC 存活和静止的基因的表达。

总之，该研究表明 Endoglin 对于限制 BMP9/10 诱导的 SMAD1/5 磷酸化水平是必要的，该磷酸化可保护 FSS 暴露的 ECs 免受炎症标志物 EDN1 的表达。研究发现 Endoglin 定位于 Caveolin-1 阳性信号转导的 EEs。这个新发现的 EE 区室对于 LSS 诱导的致动脉粥样硬化性 BMP 信号的增加至关重要。未来需要进一步研究 BMP 信号串扰与 FSS 机械生物学，特别是考虑到异常 BMP 信号转导在 HHT 和 PAH 等血管疾病中的作用。

参考文献：Mendez PL, Obendorf L, Jatzlau J, Burdzinski W, Reichenbach M, Nageswaran V, Haghikia A, Stangl V, Hiepen C, Knaus P. Atheroprone fluid shear stress-regulated ALK1-Endoglin-SMAD signaling originates from early endosomes. BMC Biol. 2022 Sep 28;20(1):210. doi: 10.1186/s12915-022-01396-y. PMID: 36171573; PMCID: PMC9520843.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36171573/

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