干扰素是剪切力刺激的人主动脉瓣内皮细胞中的促炎性细胞因子

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）已成为世界范围内是最常见的瓣膜性心脏病之一。在过去的几十年中，一系列临床、体内和体外研究都指出炎症是CAVD早期的主要机制。在瓣膜内皮细胞（VEC）中，已知TNF-α可诱导炎症和氧化应激以及内皮向间充质转化，IL-6也促进了这一过程。免疫细胞因子I型和II型干扰素（IFNs）已被证明可促进瓣膜间质细胞（VIC）的炎症和钙化。然而，IFNs在VEC中的影响仍然未知。I型和II型IFNs、下游Janus 激酶（JAK）和信号转导器（如转录激活因子）在调节免疫和炎症反应中起关键作用。在主动脉瓣中，一份报告显示，IFN-γ在患病人瓣膜的钙化区域表达。

主动脉瓣内皮持续暴露于血流动力学力，对于维持瓣膜完整性和稳态至关重要。大多数指向VEC在CAVD中具有保护作用的证据都来自体外和离体模型。值得注意的是，钙化主要发生在主动脉瓣的纤维层，这一过程可能由主动脉侧（aVEC）或心室侧（vVEC）内皮细胞之间的特异性差异调节。主动脉瓣两侧出现显著的血流动力学差异。主动脉表面暴露于振荡性低剪切流，心室侧暴露于层流高剪切流，这被认为会促进血管系统内抗动脉粥样硬化区域的存在。

在西班牙巴利亚多利德大学和西班牙国家研究委员会、伦敦帝国理工学院国家心肺研究所等研究团队的一项实验项目中，曾探讨了IFNs对人类VEC的影响，重点关注炎症、免疫细胞粘附和细胞迁移，并将其与典型的促炎细胞因子TNF-α的作用进行比较。此外，还分析了潜在的两侧特异性差异和流动模式的影响。研究结果可以为细胞因子及其在VEC中的相互作用提供新的见解，可能与理解CAVD的发生有关。相关研究成果发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells”。

首先，研究人员试图调查人VEC是否对I型和II型IFNs有反应，利用由瓣膜主动脉侧和心室侧细胞组成的混合VEC群，在静态条件下与重组I型和II型IFNs（分别为IFN-α和IFN-γ）一起孵育。数据显示，IFN-α和IFN-γ均促进VEC中酪氨酸701残基处的STAT1磷酸化。为了阐明IFN诱导的表型，分析了与内皮功能相关的基因的表达，即血管内皮生长因子A（VEGFA）和内皮型一氧化氮合酶（NOS3），分析显示，IFNs不影响VEGFA和NOS3的表达。相比之下，TNF-α诱导VEGFA上调，说明两种细胞因子在人VEC中具有不同效应。

IFNs被认为是人VIC中促炎性细胞因子，因此研究了IFNs 的炎症潜能。结果表明，在静态条件下的VEC中，IFN-α和IFN-γ促进了炎症主转录因子NF-κB 的激活。IFNs一致地上调下游基因的表达，即细胞间细胞粘附分子（ICAM）-1和血管细胞粘附分子（VCAM）-1。TNF-α是最有效的促炎细胞因子。此外，qPCR分析显示，IFN-α和IFN-γ增加了IL6基因的表达，然而，只有 IFN-α 增加了 IL8 表达，这表明 VEC 响应中的 IFN 型特异性。总之，数据显示，I型和II型IFN在从人类非钙化瓣膜分离的VEC中是促炎细胞因子。

接下来，研究了从瓣膜主动脉侧或心室侧特异性分离的VEC中IFN-γ对缺氧诱导因子（HIF）-1α表达的潜在特异性反应。为了模拟不同的剪切模式，在轨道振动台涡流系统中培养并激活细胞，该系统在边缘（单轴）和中心（多向）之间产生剪切应力量的差异。

分析显示，TNF-α，而非IFN-γ，在处理24小时后促进aVEC中的HIF-1α的稳定，然而，IFN-γ和TNF-α之间的相互作用对于促进vVEC中的HIF-1α稳定是必要的（图1 A）。HIF-1α调节参与代谢和血管生成的几个下游基因的表达，如VEGF-A。aVEC活化后，没有细胞因子能促进VEGF-A的分泌（图1 B）。

此外，TNF-α，而非IFN-γ，触发了aVEC和vVEC中的NOS3蛋白下调（图1 C），表明这些细胞因子诱导的内皮表型存在差异。总之，数据显示，在剪切应力条件下，IFN-γ和TNF-α对两侧特异性VEC中HIF-1α和NOS3表达有明显影响。

图1 TNF-α而不是IFN-γ促进了两侧特异性VEC中的HIF-1α的免疫诱导以及NOS3蛋白下调。（A-C）aVEC和vVEC暴露于剪切48小时，然后用指定的配体处理24小时。

内皮细胞迁移在血管生成中至关重要，并受HIF-1α调节。因此，分析了细胞因子在aVEC和vVEC的多轴剪切流下修复伤口愈合的能力。划痕测定显示，TNF-α和缺氧诱导剂氯化钴2（CoCl2）在 aVEC 中促进伤口完全愈合，但在 vVEC 中没有。相反，IFN-γ显著减少vVEC中的伤口愈合，并显示出减少aVEC迁移的趋势，并且还抑制了TNF-α介导的细胞迁移。总的来说，数据证明了瓣膜侧和细胞因子在细胞迁移方面的差异。

接下来，分析了IFN-γ在两侧特异性VEC中诱导的炎症表型。ELISA分析显示，IFN-γ和TNF-α诱导IL-6分泌，其中TNF-α是最有效的细胞因子，而两种细胞因子合作增强了这种效果。此外，IFN-γ显著促进了IP-10/CXCL10的分泌，而TNF-α诱导的分泌在aVEC中的分泌量显著高于vVEC。

对于粘附分子表达，蛋白质印迹表明，IFN-γ显著诱导ICAM-1和VCAM-1，尽管程度低于TNF-α，并且aVEC和vVEC之间没有显著差异（图2）。需要注意的是，HIF-1α的化学稳定不影响粘附分子表达，这表明该转录因子不参与这些炎症反应（图2）。总的来说，数据表明IFN-γ促进VEC的促炎表型，表现出与TNF-α的差异。

图2 IFN-γ和TNF-α促进aVEC和vVEC中的粘附分子表达。将细胞暴露于剪切48小时，并用指定的配体处理24小时，并通过蛋白质印迹分析全细胞提取物的ICAM-1和VCAM-1表达。

免疫细胞浸润是CAVD最早的事件之一。为了阐明这一过程，实验最后研究了多轴和单轴流动模式对单核细胞粘附到瓣膜内皮细胞的影响。结果表明，IFN-γ 和 TNF-α 增加了多轴和单轴剪切流下单核细胞对aVEC 的粘附（图3 A-D）。值得注意的是，THP-1粘附的数量和 THP-1/VEC 比值显示，与孔的边缘（单轴）相比，中心（多轴）的粘附量明显更高（图3 D）。此外，TNF-α与IFN-γ联合进一步增强促粘附效应（图3 D）。总之，数据证明了IFN-γ和TNF-α对单核细胞粘附到aVEC单层的流动特异性影响。

图3 IFN-γ和TNF-α在多轴剪切流条件下更高程度地促进单核细胞对aVEC单层的粘附。

图4 描述IFN在剪切应力位点特异性VEC中影响的模式。
（A）在静态条件下的混合VEC中，IFN促进以诱导STAT1和NF-κB路线以及随后的炎症分子为特征的促炎表型。（B）两侧特异性VEC暴露于剪切流，细胞因子（IFN-γ，TNF-α）会促进炎症。此外，在多轴剪切流条件下，aVEC更容易发生细胞因子介导的单核细胞粘附。最后，TNF-α和HIF-1α 的化学诱导剂（CoCl2）促进了迁移效应，而IFN-γ降低了TNF-α介导效应。总之，数据揭示了细胞因子和流动模式之间的差异。

总的来说，该研究数据揭示了关于IFNs在人VEC中的炎症作用的新发现，显示了TNF-α在迁移和NOS3下调方面的差异，还描述了多轴剪切流条件可能会增加免疫细胞对炎症瓣膜内皮细胞的粘附。这项研究提供了新的发现，这些发现可能与了解疾病的初始炎症阶段有关，并支持将JAK/STAT通路作为CAVD潜在相关途径的研究。

参考文献：Parra-Izquierdo I, Sánchez-Bayuela T, López J, Gómez C, Pérez-Riesgo E, San Román JA, Sánchez Crespo M, Yacoub M, Chester AH, García-Rodríguez C. Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2021 Sep 30;22(19):10605. doi: 10.3390/ijms221910605. PMID: 34638942; PMCID: PMC8508640.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34638942/

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