从2D到3D共培养系统：研究神经细胞相互作用的共培养模型

中枢神经系统（CNS）是人体内结构和功能最复杂的系统。中枢神经系统的基本组织是神经组织，主要由神经元（神经细胞）和神经胶质细胞组成。神经元和神经胶质细胞以极其精妙和高度复杂的方式组合在一起，形成具有三维（3D）结构的系统。通过神经元或其他细胞之间复杂有序的连接，形成各种神经传导通路和神经回路，控制和调节器官系统的功能活动，维持机体与外界环境的统一。

因此，对中枢神经系统的理解不能局限于单一类型的细胞或单个器官，而应基于多层次和多角度的多器官认识。细胞共培养系统的出现使得阐明体外神经细胞之间的相互作用和复制复杂的神经回路成为可能。共培养系统可用于研究：（1）细胞分化；（2）细胞的功能和活性；（3）细胞增殖和迁移；（4）中枢神经系统的发展；（5）代谢机制。

基于此，吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系、病原生物学系课题组的一项研究曾综述了与神经细胞相互作用相关的基于二维（2D）和3D共培养系统的体外模型，同时进一步讨论了类器官共培养系统应用的最新进展，特别关注那些通过神经调节应用分析证明了明确相互作用的系统。

2D共培养模型在神经细胞相互作用研究中的应用

细胞共培养模型可用于观察细胞之间或细胞与其周围微环境之间的相互作用，可分为直接接触共培养模型和间接接触共培养模型。

直接接触共培养是指将两种或两种以上的细胞按一定比例混合并在特定条件下接种在同一界面上。该系统最明显的优势是它可以证明神经胶质细胞和神经元细胞之间的相互作用。此外，还可以在共培养系统中添加额外的调节因子，如免疫细胞因子，以研究细胞间相互作用。

饲养层细胞共培养系统是将细胞接种在单层细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等）上的系统。这些饲养层细胞用有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理以抑制细胞分裂，但保留分泌生长因子的能力。基于两种细胞类型的共培养，建立了由神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞组成的三重培养系统，该系统更真实地模拟了体内的神经炎症反应，从而可以更好地了解细胞串扰对神经炎症的影响。

间接接触共培养是培养两种或两种以上不同的细胞类型，使细胞通过培养基内的化学因子相互作用，而没有物理直接接触。实现此目的的方法如图1。例如，通过Transwell方法对施旺细胞（SCs）和神经元进行共培养表明，SCs分泌的β-细胞素可以影响神经元行为并增加突触长度，从而促进神经再生。

从2D共培养条件获得的数据可能具有与体内不同的结果，2D培养物中细胞的生长模式、形态和功能与体内生理条件下的细胞明显不同。2D细胞培养中的异常细胞形态会影响细胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表达以及许多其他细胞过程。

图1 实现间接接触共培养的方法。（1）条件培养基：收集含有各种生长因子或细胞分泌刺激物的细胞培养上清液，以研究因子对细胞生长或分化的影响。（2）盖玻片上的饲养层细胞：分泌某些因子的细胞也可以接种在盖玻片上，以避免与接种在培养皿中的细胞直接接触。（3）Transwell培养系统：Transwell室中的细胞共培养系统。

3D共培养模型在神经细胞相互作用研究中的应用

由于3D共培养系统模拟体内环境，因此为研究复杂的神经细胞相互作用提供了一种可靠的方法，例如各种神经细胞之间的协同和保护作用。3D共培养技术可以展示细胞活性和细胞间的分化、蛋白表达等反应，实现真实的细胞生物学和功能。在这里，研究将3D共培养系统分为基于细胞的3D共培养系统，基于组织切片的3D共培养系统和基于类器官的3D共培养系统（图2）。

图2 3D共培养模型在神经细胞相互作用研究中的应用：（1）不同类型的神经细胞在凝胶化后可以包裹成具有一定3D结构的水凝胶。（2）细胞可以与器官型切片共培养，保留了体外系统的主要优点。（3）可以开发基于类器官的共培养系统来研究涉及多个系统或组织的疾病过程。

基于细胞的 3D 共培养系统

为了构建模拟体内结构的3D结构，可以将神经细胞包裹到水凝胶中，凝胶化后具有一定的3D结构。天然和合成水凝胶都已用于3D系统的生物工程。

基底胶是一种天然水凝胶，对维持细胞生长、促进干细胞分化为神经元、促进轴突延伸等具有积极作用。除基底胶外，胶原蛋白水凝胶对神经谱系也有类似的作用。Yang等人报道，小分子和胶原蛋白水凝胶的联合治疗可以诱导原位内源性NSCs向神经元分化并恢复受损功能。另一种天然水凝胶，海藻酸盐，也被用作构建3D细胞培养系统的潜在生物材料，因为藻酸盐的结构类似于透明质酸，透明质酸是大脑ECM的主要成分。研究表明，包裹的人多能干细胞（hPSCs）衍生神经元粘附在水凝胶基质上并形成3D神经网络。

最近的研究表明，天然材料，如基底胶和海藻酸盐，可以设计和合成水凝胶复合材料，并开发用于制造具有孔隙或排列结构的支架。研究表明，水凝胶复合材料可以成为具有高导电性和生物相容性以促进神经再生的有前途的材料。脱细胞组织基质（DTM）是开发个性化临床方法的另一种有前途的支架，并且在促进神经组织再生方面显示出其独特而有益的特征，特别是那些来自CNS的神经组织再生。

总之，水凝胶支架可以轻松支持3D神经细胞培养，这些支架是多孔的，有助于氧气、营养物质和代谢物的运输。因此，细胞可以在支架网络内增殖和迁移，并最终粘附在支架网络，然而，用这种技术获得的球体的大小应该得到控制，因为一个大的3D球体会由于缺乏营养而引起中心坏死。

基于组织切片的 3D 共培养系统

组织切片保留了体外系统的主要优点，弥补了细胞系功能不足，并在一定程度上保持了组织的形态结构、组织活性和器官功能，从而提供了有利于神经分化和神经元回路的有利微环境。器官型切片的另一个优点是在其生理状态下保存血管系统的3D排列。

器官型切片和共培养技术的结合对各种神经通路和疾病的模型特别有益。例如，在缺氧-葡萄糖条件下，海马组织切片可用于模拟氧化应激引起的CNS损伤。成人全脑冠状切片和胶质瘤干细胞（GSCs）的共培养可用于模拟胶质母细胞瘤肿瘤-宿主细胞相互作用，并研究多形性胶质母细胞瘤的治疗。除了脑切片，脊髓切片还广泛用于神经学研究，如神经修复和再生。在一项研究中，将大鼠脊髓切片与周围神经移植物共培养，并给予不同浓度的米诺环素，以观察其对运动神经元存活率的影响。这种共培养系统似乎是一个有用且有前途的模型，用于进一步研究驱动神经和内皮组织之间复杂相互作用的机制。

虽然基于切片的共培养系统提供了高度贴近人体的微环境，但仍存在一定的局限性，如组织切片的制作和操作过程复杂，需要相对精细的操作和经验积累。此外，与其他体外培养物一样，脑切片不能完全再现体内的生理环境。

基于类器官的 3D 共培养系统

一种新的来源于PSCs的3D模型，被称为类器官，在神经发育建模、疾病机制分析和开发潜在疗法方面具有很大的前景。类器官，如脑类器官和脊髓类器官，可以在体外复制神经发育，探索不同CNS区域之间的相互作用，探索人类CNS的进化及其独特的调控机制。因此，可以开发基于类器官的共培养系统来研究涉及多个系统或组织的疾病过程，例如神经肌肉疾患（NMDs），肌萎缩侧索硬化症（ALS）以及不同CNS和局部回路之间的复杂连接。

2017年，Birney等人生成了一个人体3D微生理系统，其中包括功能整合的谷氨酸能和γ-氨基丁酸能（GABA）神经元，类似于背侧或腹侧前脑，以捕获更复杂的发育过程。此外，融合区域特异性类器官，然后进行实时成像，能够分析人类中间神经元迁移和整合，以模拟人类中间神经元迁移。最典型的基于类器官的共培养系统是脑-脊髓-骨骼肌组合，可用于模拟NMD。2019年，Lancaster的研究小组发表了在气液界面培养脑类器官的方案，并成功利用脑类器官控制肌肉收缩。该系统不仅大大提高了神经元的成熟和存活率，而且侵入了脑类器官神经元的轴突来控制脊髓。通过控制脊髓，然后控制肌肉，不同CNS和局部回路之间的复杂连接在体外得以完美再现。

利用共培养系统建立微生物感染神经疾病模型

某些微生物（如病毒）可以穿过血脑屏障并进入中枢神经系统。因此，类器官可以与微生物共培养，以建立微生物感染的神经疾病模型。

寨卡病毒（ZIKV）是一种蚊媒病毒，成人感染通常较轻，而孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形。使用ZIKV感染的前脑类器官，Haddow等人观察到与对照组相比，受感染的前脑类器官的大小显著减小。这项研究表明，在进入胎儿大脑后，ZIKV感染神经前体细胞（NPCs）并引起细胞凋亡，在皮质发育中引起小的头状缺陷。除了揭示其机制外，ZIKV感染的脑类器官也可用于筛选治疗ZIKV感染的药物。

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019年冠状病毒病（COVID-19）会引起可能致命的呼吸道症状。然而，在肾脏、心脏、肝脏和大脑等其他器官也发现了损伤和功能障碍。越来越多的临床证据显示神经系统症状，尸检结果也表明，一些患者的大脑中存在病毒。由于这些特征，脑类器官被广泛用于研究病毒感染CNS的位置及其潜在靶标。研究表明，SARS-CoV-2病毒感染脑脉络丛，可破坏脑类器官中的血脑屏障。另一项研究使用人iPSC衍生的单层脑细胞和区域特异性脑类器官来确定感染与炎症反应和细胞功能缺陷有关。研究结果支持脑类器官为发现COVID-19神经精神并发症的病理生理学线索和潜在治疗选择提供了一种有希望的工具。

总而言之，共培养系统，尤其是基于类器官的共培养系统，是控制和分析细胞相互作用的强大工具和技术。然而，类器官模型是人体组织实验研究中的最新技术。与传统模式相比，仍处于探索阶段。其稳定性、可重复性、可扩展性以及如何精确控制微环境条件已成为类器官共培养技术发展中需要克服的问题。这些努力大多仍然是原则证明，而不是现有模式的充分发展和广泛适用的替代办法，具有固有的优势和局限性。为了创建用于细胞相互作用研究的相关共培养系统，需要将类器官模型与标准化微设备相结合。

参考文献：Liu R, Meng X, Yu X, Wang G, Dong Z, Zhou Z, Qi M, Yu X, Ji T, Wang F. From 2D to 3D Co-Culture Systems: A Review of Co-Culture Models to Study the Neural Cells Interaction. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13116. doi: 10.3390/ijms232113116. PMID: 36361902; PMCID: PMC9656609.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36361902/

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