流体剪切应力通过 lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 轴调控成骨细胞增殖和凋亡

机械负荷已被证明可以调节骨重塑和体内平衡。流体剪切应力（FSS）是机械刺激的一种形式，可以激活许多信号通路并促进成骨细胞增殖和分化。以往研究表明，生理性FSS（12 dyn/cm2）可通过ERK5 / AP-1，Gαq / ERK5和NFATc1 / ERK5信号通路促进MC3T3-E1 成骨细胞的增殖作用，通过 ERK5-AKT-FoxO3a-Bim/FasL 信号通路抑制 MC3T3-E1 成骨细胞的凋亡作用。

MiRNAs已被证明参与调节骨形成。此外，一些miRNAs在成骨细胞增殖和分化过程中对机械刺激敏感，几种miRNAs已被证实参与调节成骨细胞凋亡，如miR-148a，miR-182-5p和miR-543。Mai 等人证明miR-34a下调可促进FSS下的成骨细胞分化。然而，miR-34a是否能调节FSS下成骨细胞的增殖和凋亡，以及可能的机制还有待探索。

越来越多的证据表明，长链非编码RNAs（lncRNAs）通过与miRNAs的竞争性结合来调控靶基因。LncRNAs也可调节成骨分化，例如，lncRNA MSC-AS1通过miR-140-5p促进成骨分化。作为复杂的 lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络的一部分，lncRNAs 可影响骨质疏松症患者的骨形成和骨吸收。然而，lncRNAs在FSS下成骨细胞中的作用尚不清楚。

基于此，甘肃省兰州大学第二医院骨科的课题组曾研究了miR-34a在FSS下是否能调控成骨细胞增殖和凋亡及其可能的机制。研究结果揭示了lncRNA TUG1 / miR-34a / FGFR1轴在FSS调控的成骨细胞增殖和凋亡中的关键作用，并可能建立针对骨质疏松症的潜在治疗策略。相关内容发表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 杂志题为“Fluid shear stress regulates osteoblast proliferation and apoptosis via the lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 axis”。

首先，mimic-34a 和 inhibitor-34a分别用于上调和下调MC3T3-E1细胞中miR-34a的水平。EdU 实验和 CCK-8 实验结果显示，上调 miR-34a 可抑制细胞增殖，而下调 miR-34a 可促进细胞增殖。接下来，评估了miR-34a对成骨细胞凋亡的影响。流式细胞分析显示，mimic-34a 转染可显著增加细胞凋亡率。Hoechst染色也表明，miR-34a的上调促进了细胞凋亡。这些数据表明，miR-34a的下调促进了成骨细胞的增殖并抑制了细胞的凋亡。

qRT-PCR结果表明，miR-34a在FSS下持续下调，并在60 min时达到最低水平（图1 A）。之前的研究表明，FSS促进成骨细胞增殖并抑制成骨细胞凋亡。为了研究miR-34a是否参与FSS调节的成骨细胞的增殖和凋亡，先使用 mimic-34a 转染 MC3T3-E1 细胞，然后将 FSS（12 dynes/cm2）作用于细胞 0、30、60 或 90 min。结果表明，mimic-34a 转染可显著抑制 FSS 对细胞增殖的促进作用（图1 B-D）。另一方面，流式细胞分析显示，mimic-34a 转染可减弱 FSS 对成骨细胞凋亡率的降低作用（图1 G）。这些结果表明，FSS对miR-34a的下调促进了成骨细胞的增殖并抑制了成骨细胞的凋亡。

图1 FSS 下调 miR-34a 表达水平，miR-34a 上调削弱 FSS 下成骨细胞增殖和凋亡的改变。

接下来，为了研究FGFR1在成骨细胞增殖和凋亡中的功能，使用 pcDNA3.1-FGFR1过表达 MC3T3-E1 细胞中的 FGFR1，siRNA-FGFR1 敲低 MC3T3-E1 细胞中的 FGFR1。结果显示，pcDNA3.1-FGFR1 转染可促进细胞增殖，而 siRNA-FGFR1 转染可抑制细胞增殖。此外，流式细胞分析显示，与阴性对照相比，siRNA-FGFR1转染组的凋亡率明显上调。Hoechst染色也显示，FGFR1沉默促进成骨细胞凋亡。

为了确定FGFR1是否介导miR-34a调控的成骨细胞的增殖和凋亡，将 mimic-34a 和 pcDNA3.1-FGFR1 共转染到 MC3T3-E1 细胞中。结果表明，过表达 miR-34a 可抑制细胞增殖，而共转染 mimi-34a 和pcDNA3.1-FGFR1 可减弱这种抑制作用（图2 A、B）。共转染 mimic-34a和 pcDNA3.1-FGFR1 可部分逆转由上调 miR-34a 引起的PCNA、CDK4 和 Cyclin D1 的 mRNA 和蛋白质的下调作用（图2 C、D）。此外，与 mimic-34a 转染组相比，mimic-34a 和pcDNA3.1-FGFR1 共转染组的细胞凋亡率更低（图2 E）。Hoechst染色也表明，尽管 mimic-34a 可促进细胞凋亡，但 pcDNA3.1-FGFR1 可抑制这种影响（图2 F）。蛋白质印迹进一步证实，pcDNA3.1-FGFR1可减弱由 miR-34a 上调引起的 Bax 和 cleaved caspase-3 的增加，以及 Bcl-2 的降低（图2 G）。这些结果表明，miR-34a至少部分通过调节MC3T3-E1细胞中的FGFR1发挥了抗增殖和促进凋亡作用。

图2 FGFR1介导miR-34a调节的成骨细胞增殖和凋亡。

然后，实验通过 TargetScan 和 StarBase 数据库预测 miR-34a 的靶基因。其中主要关注 FGFR1，它是已报到参与调控成骨细胞增殖和凋亡的 FGFR 家族成员之一。为了验证miR-34a 是否可直接靶向 FGFR1，构建了荧光素酶报告载体（WT 和 MUT）。数据表明，FGFR1 是 miR-34a 的直接靶点。

为了确认 FSS 对 FGFR1 表达水平的影响，将 FSS 作用于 MC3T3-E1 细胞1小时。qRT-PCR 和蛋白质印迹证实，FSS 可显著增加 FGFR1 的 mRNA 和蛋白质表达水平。此外，mimic-34a 仅可抑制 FSS 上调的 FGFR1 蛋白质表达水平，而对 FSS 上调的 FGFR1 mRNA 表达水平几乎没有影响。上述结果表明，在FSS下，miR-34a靶向MC3T3-E1细胞中的FGFR1。

此外，LncRNAs 通常可作为 ceRNAs 通过竞争性结合 miRNAs 来调节靶基因表达。为了确认 miR-34a 是否受 lncRNA 调控，使用 StarBase 数据库预测了可以与 miR-34a 相互作用的 lncRNAs。在许多潜在靶点中，可参与调节成骨细胞增殖和分化作用的 lncRNA TUG1 是一个重要的靶点。

为了研究 FSS 对 lncRNA TUG1 表达水平的影响，将 FSS（12 dynes/cm2）作用于 MC3T3-E1 细胞 0、30、60 或 90 min。qRT-PCR结果表明，FSS 可显著上调 MC3T3-E1 细胞中 lncRNA TUG1 的表达水平（图3 A），进一步分析证实lncRNA TUG1定位在细胞质和细胞核中（图3 B）。然后，发现miR-34a的上调可显著抑制 lncRNA TUG1 的表达（图3 C），敲低lncRNA TUG1可显著增加miR-34a的表达（图3 D）。为了验证lncRNA TUG1 是否可直接与 miR-34a 相结合，构建了荧光素酶报告载体（WT 和 MUT ）（图3 E）。结果显示，上调 miR-34a 可减弱 WT lncRNA TUG1 荧光素酶活性，下调 miR-34a 可增强 WT lncRNA TUG1荧光素酶活性，但对 MUT lncRNA TUG1 的荧光素酶活性没有影响（图3 F）。这些结果表明，LncRNA TUG1 和 miR-34a 相互作用并相互抑制。

图3 LncRNA TUG1 和 miR-34a 相互作用并相互抑制。

最后，通过lncRNA TUG1过表达和敲除实验，验证了lncRNA TUG1对成骨细胞增殖和凋亡的调控作用。结果表明，lncRNA TUG1 的过表达促进了成骨细胞增殖。相反，lncRNA TUG1敲低抑制成骨细胞增殖。流式细胞分析表明，沉默lncRNA TUG1可提高细胞凋亡率。Hoechst染色也显示siRNA-TUG1转染促进细胞凋亡。

接下来，确认了lncRNA TUG1是否调节FGFR1的表达。蛋白质印迹显示，lncRNA TUG1的过表达显著增加FGFR1水平。相反，lncRNA TUG1敲低抑制了FGFR1蛋白的表达。此外，siRNA-TUG1和inhibitor-34a 在FSS作用前共转染到MC3T3-E1细胞中，结果显示，inhibitor-34a 转染部分逆转了FSS下siRNA-TUG1诱导的FGFR1蛋白质表达水平的降低作用。这些结果表明，lncRNA TUG1通过靶向miR-34a/FGFR1通路促进FSS下成骨细胞的增殖并抑制其凋亡。

图4 LncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 轴在成骨细胞中的作用示意图。
在 FSS 作用下，MC3T3-E1 成骨细胞中 miR-34a 的表达水平下调，并可与上调的 lncRNA TUG1 相互作用。MiR-34a 的下调可通过靶向 FGFR1 促进成骨细胞的增殖作用并抑制成骨细胞的凋亡作用。

总之，该研究证明了miR-34a在成骨细胞中响应FSS而下调。miR-34a的下调通过靶向FGFR1促进成骨细胞增殖并抑制成骨细胞凋亡。此外，lncRNA TUG1通过吸附 miR-34a 上调 FGFR1 的表达，从而促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡（图4）。因此，研究结果揭示了lncRNA TUG1 / miR-34a / FGFR1轴在FSS调控的成骨细胞增殖和凋亡中的作用，并可能为骨质疏松症提供有希望的治疗策略。

参考文献：Wang X, He J, Wang H, Zhao D, Geng B, Wang S, An J, Wang C, Han H, Xia Y. Fluid shear stress regulates osteoblast proliferation and apoptosis via the lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 axis. J Cell Mol Med. 2021 Sep;25(18):8734-8747. doi: 10.1111/jcmm.16829. Epub 2021 Aug 5. PMID: 34350720; PMCID: PMC8435422.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34350720/

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