与内皮细胞共培养有利于人慢性粒细胞白血病干细胞和祖细胞的体外维持

慢性粒细胞白血病（CML）是一种骨髓增殖性疾病，表现为成熟和未成熟的粒细胞不受调控的异常增殖，导致外周血白细胞大量增生。CML起源于白血病干细胞（LSC，CD34+CD38-lin-cells）群体。LSCs存在于骨髓微环境（BMM）中，与正常的造血干细胞（HSCs）共存。在疾病进展过程中，HSCs被LSCs及其子代取代。研究已经表明，白血病细胞会改变其周围的生态位，例如，通过诱导促炎环境，为LSC的自我更新、分化和存活创造宽松的空间。

血管微环境已被确定为CML发展的重要因素。在小鼠模型中观察到，恶性肿瘤建立后骨髓（BM）中血管化增加，在CML患者的BM 中同样，这提示其与预后不良有关。据报道，在CML小鼠模型中，BM内皮细胞可以调节白血病干细胞和祖细胞的静息和增殖。然而，这一观察结果尚未在原代人类细胞中得到评估。

在墨西哥国立自治大学、墨西哥塞古罗社会研究所的一项报告中，描述了原始白血病细胞与内皮集落形成细胞（ECFC）的共培养，作为白血病细胞与血管微环境相互作用的体外模型，以分析内皮细胞对维持CML患者干细胞和祖细胞的影响。

与内皮细胞共培养可维持原始 CML 细胞

基于血管微环境能够调节小鼠恶性造血的事实，实验建立了一个体外模型，其中人内皮细胞（EC）与富含干细胞和祖细胞（认为是原始细胞）的CML细胞群共培养。如图1 a，CML细胞与EC的共培养对CML细胞有维持作用。在没有EC（对照）的情况下没有观察到这种效果。值得注意的是，当在没有内皮细胞但存在造血刺激因子（细胞因子对照）的情况下培养细胞时，CML细胞群的总数量翻了一番。

内皮细胞与CML细胞共培养，不接触或接触，都导致Lin-CD34+ CD38- 细胞水平分别比初始细胞数增加110%和170%（图1 b）。后者与细胞因子对照中的增加相似。在对照培养（仅基础培养基）中，Lin-CD34+ CD38- 细胞的数量减少（图1 b）。在Lin-CD34+ CD38+ 细胞中，当它们与EC接触时观察到增加了 20%。这种增加在细胞因子对照培养中没有发生，并且与阴性对照和无接触共培养相比具有统计学意义，其中细胞群的总数量减少了一半（图1 c）。

为了确定共培养对集落形成细胞（CFC）水平的影响，进行了集落测定。图1 d显示当白血病细胞与EC接触时，CFC水平得以维持；相比之下，在无接触共培养中，CFC水平降低了50%。在细胞因子对照和仅基础培养基对照中，CFC数量分别减少了65%和83%（图1 d）。此外，在无接触共培养中，观察到大多数集落对应于骨髓（CFU-G和CFU-M）和晚期红系（CFU-E）集落，而在接触共培养中，观察到高比例的BFU-E，CFU GM和CFU-Mix集落，这表明直接接触共培养有利于更原始祖细胞的存活。

为了鉴定可能参与培养中白血病细胞维持的可溶性因子，在培养3天后对上清液进行了多重分析。在无接触共培养中，发现与骨髓分化相关的炎性细胞因子和可溶性分子的大量产生。另一方面，在直接接触培养中，炎症分子的分泌减少，仅观察到高水平的IL-1a，IL-6和SCF（图1 e）。值得注意的是，所有这些细胞因子都参与CML细胞维持。这些数据表明，与内皮细胞的接触有利于维持培养中的CML原始细胞。

图1 与内皮细胞共培养可维持CML原始细胞。

（A）在EC共培养三天后评估总CML细胞数。（B）共培养3天后评估干细胞（Lin-CD34+ CD38-）或（C）祖细胞（Lin-CD34 + CD38 +）细胞数。（D）共培养三天后，将3000个造血细胞在甲基纤维素中传代培养14天，并评估CFC。（E）通过多重分析物测定进行细胞因子检测。

白血病干细胞仍然附着在内皮细胞上

基于上述结果，表明内皮细胞和CML原始细胞之间直接接触的重要性，因此接下来专注于直接接触共培养。实验观察到，在共培养3天后，检测到两种不同的造血细胞：一部分由直接附着在内皮上的造血细胞（cc贴壁）组成，占总细胞的15.9%，第二部分留在共培养的上清液中（cc非贴壁），占细胞的84%（图2 a、b）。有趣的是，这些比例在正常造血细胞的培养中有很大的不同（图2 a），其中附着在内皮上的细胞数量较多（40.2%）。

当在每个共培养组中分析细胞免疫表型时，以不同的频率检测到干细胞、祖细胞和成熟细胞（图2 c、d）。在贴壁部分中，16%，61% 和 22% 分别显示干细胞，祖细胞和成熟细胞免疫表型。在非贴壁部分中，具有干细胞，祖细胞和成熟细胞免疫表型的细胞百分比分别为9%，74% 和17%。值得注意的是，Lin-CD34+ CD38+ 细胞的增加与评估的CFC数量相关（图2 e）。

考虑到CD26已被作为是 CML干细胞的特异性标志物，因此在共培养的总造血细胞以及直接接触共培养物的贴壁和非贴壁组中评估了其表达。图2 f显示，在EC存在3天和6天后，lin-CD34+ CD38- CD26+ 细胞的水平分别增加50%和120%。与这一结果一致的是，3天后在附着和非附着到内皮的细胞中检测到CD26的表达（图2 g），而成熟细胞的数量（CD34- Lin+，图2 d）和骨髓细胞（CD14+，图2 h）细胞减少。

当使用MEG-01 CML细胞系（人成巨核细胞白血病细胞系）时，也观察到了类似的结果。事实上，干细胞群优先富集贴壁部分（从0时的0.25% 到共培养3天后的1.34%）。这些结果表明，在培养系统中，分化和未分化的CML细胞可能对内皮细胞具有不同的亲和力。

图2 CML原始细胞对内皮微环境具有不同的亲和力。

（A）CML和NBM接触共培养中贴壁和非贴壁造血细胞的百分比。（B）与贴壁（右）和非贴壁（左）细胞组共培养的代表性照片。（C）代表性点图和（D）在实验开始（零时间）和三天后不接触（对照）或存在EC时，分别分析贴壁和非贴壁部分部分的不同CML种群的百分比。（E）共培养三天后，将3000个造血细胞在甲基纤维素中传代培养14天并评估CFC。（F）CML干细胞CD26+ 在共培养3天和6天后进行评估，以及（G）贴壁和非贴壁部分。（H）CD14+ 髓系细胞的百分比。

与EC共培养可调控CML LSC的增殖状态

为了确定EC在CML增殖和干细胞免疫表型保留中的作用，在24、48和72 h用CFSE多重染色跟踪CML 细胞（CD45+）和干细胞（CD34+ CD38-）群，并在EC存在下共培养3天后跟踪原始免疫表型标记。

图3表明，在MEG-01细胞系的总CML群中，保持附着在EC上的部分具有最高的增殖潜力（图3 a，红色直方图），与细胞分裂指数的显著增高相关（图3 b）。在原代CML细胞总群中观察到相同的结果（图3 d，红色直方图和3 e），但在正常骨髓细胞中未检测到，其中贴壁和非贴壁细胞显示出相似的增殖，也具有相似的细胞分裂指数。

当跟踪来自MEG-01细胞系（CD34+ CD38-）和一个CML原代样品（lin-CD34+ CD38-）的干细胞群时，相对于非贴壁细胞，粘附在内皮层的部分观察到更多的细胞分裂（图3 a、d）。这种增殖能力比之前描述的CML细胞总数更明显。与这一结果一致，MEG-01细胞的贴壁部分的细胞分裂指数高于非贴壁部分的干细胞（图3 c）。此外，在保持粘附于EC上的CML原代细胞样品中，具有干细胞和祖细胞免疫表型的细胞总数相对于CML对照中的初始数量增加了4倍和1.7倍（图3 f、g）。这些结果表明，白血病干细胞具有在内皮微环境中保留和增殖的特殊能力，即使它们存在于贴壁部分中。

为了验证与EC接触的Lin-CD34+ CD38- 的增殖能力，在每次共培养结束时评估细胞周期状态。结果表明，与EC接触72 h后，G0期贴壁细胞数量相对于0时增加5倍，而S/G2/M期数量减少。相反，非贴壁部分的细胞增殖期（S/G2/M）增加（图3 h、i）。这些结果与正常骨髓细胞的结果不同，其中静息细胞群在共培养前后保持相似，表明这种行为是CML细胞独有的，并且取决于细胞接触。

有趣的是，G0 期粘附在EC上的细胞中有29.5% 显示出干细胞表型，相比之下，非粘附部分中只有 2.7% 的G0细胞显示出干细胞表型（图3 j）。此外，在活跃的细胞周期阶段（S/G2/M）未观察到具有干细胞表型的细胞，其中最高百分比（90%）对应于祖细胞（图3 j）。

这些结果表明，内皮微环境可以诱导CML干细胞的增殖和/或静息，这可能与两个细胞系之间建立的相互作用类型有关。

图3 内皮微环境可以诱导CML干细胞的增殖和细胞周期停滞。

（A）来自MEG-01细胞系或（D）原代CML样品的总或干细胞群中培养24，48和72小时的CFSE测定的代表性直方图。MEG-01细胞系（B）群体和（C）干细胞群（CD38 + CD34-）在共培养24、48和72小时时的细胞分裂指数。（E）共培养3天后的原代CML总细胞。共培养72小时后具有（F）干细胞（Lin-CD34+ CD38-）和（G）祖细胞（Lin-CD34+ CD38 +）免疫表型的细胞数量。（H）在不同共培养条件3天后一个CML样品的代表性点图。（I）细胞周期阶段的倍数变化。（J）每个共培养条件和细胞周期阶段不同造血亚群的百分比。

与EC共培养后改变细胞因子谱和Notch 表达

为了解释白血病细胞在内皮微环境中的持久性，在共培养3天后分析了它们的细胞因子谱。图4 a表明，与对照（无接触共培养）相比，可溶性因子（例如：IL-1a，IL-6和PIGF）显著增加，这些因子与白血病有关，以牺牲正常的造血能力为代价。可能引发慢性炎症并引起促白血病微环境的分子，如IL-8、TGF-b1、GM-CSF和MCP-1，也显著升高。这种情况可能与观察到的增殖有关，但不一定能解释细胞的静息。

考虑到在小鼠模型中粘附分子（如Notch1及其配体）参与CML干细胞和祖细胞的维持，因此实验分析了共培养组、MEG-01细胞系和内皮细胞中Notch1、Jagged 2 和DLL4的表达。结果发现，共培养72小时后，白血病细胞和内皮细胞中Notch-1和 Jagged-2 表达增加（图4 b）。该时间点（72小时）与细胞周期G0期白血病细胞停滞的时刻相关，尽管肯定还有其他分子参与其中，但这项研究的结果表明，在人类CML中，内皮微环境为维持白血病造血创造了合适的场所，并且干细胞的静息和增殖，即使在粘附条件下，也可能与通过直接接触和可溶性因子分泌物建立的通讯有关，这会导致白血病的持久性。

图4 与EC共培养后的细胞因子谱和notch 表达。

（A）共培养3天后评估共培养上清液中的细胞因子浓度。（B）采用流式细胞术分析共培养24、48和72h后内皮细胞和MEG-01细胞系中Notch1、Jagged-2 和DLL4的表达。

总之，这项研究表明，原始CML细胞和正常内皮细胞之间的共培养，没有任何额外因素的情况下，产生了一个微环境，通过它们的静息状态、增殖和分化，允许原始CML细胞在体外的维持，这似乎与炎症环境的产生有关，以及它们自身的粘附能力，可能涉及 Notch1-Jagged2 轴。在这种情况下，有必要使用源自CML骨髓的内皮细胞来评估这些相同的生物效应，其中观察到的效果可能更大，因为内皮细胞可能已经具有功能改变。

参考文献：Torres-Barrera P, Moreno-Lorenzana D, Alvarado-Moreno JA, García-Ruiz E, Lagunas C, Mayani H, Chávez-González A. Cell Contact with Endothelial Cells Favors the In Vitro Maintenance of Human Chronic Myeloid Leukemia Stem and Progenitor Cells. Int J Mol Sci. 2022 Sep 7;23(18):10326. doi: 10.3390/ijms231810326. PMID: 36142235; PMCID: PMC9499491.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36142235/

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