血流动力通过 MIEN1-ERK/MAPK 信号轴决定内皮细胞血管生成

血管生成，涉及从预先存在的毛细血管中萌发新的血管，有助于胚胎发育、组织稳态和伤口愈合。血管生成或血管修复的调控缺失是动脉粥样硬化的严重并发症。此外，血管生成异常限制了缺血性疾病的组织恢复。因此，血管生成在心血管疾病中具有巨大的血管再生潜力。

细胞行为和命运由机械微环境决定。内皮细胞（ECs）的特定机械转导机制参与调节细胞命运，从而塑造血管系统以优化流向组织的血流。研究发现，剪切应力有效调节内皮祖细胞（EPCs），在促进血管生成方面具有巨大潜力。还有报告称，增加的剪切应力通过静脉丛中的 BMP-依赖性途径抑制血管生成。因此，剪切应力因其在血管再生中的潜在作用而得到认可。然而，不同的血流模式（层流和扰动流）如何决定血管生成在很大程度上仍不清楚。

迁移和侵袭增强子1（MIEN1）是一种在肿瘤组织中广泛表达的新基因，对细胞的侵袭和迁移具有重要的控制作用。此外，MIEN1 维持肌动蛋白细胞骨架的可塑性以增强细胞运动性。EC 的迁移对血管生成至关重要，血管生成受机械刺激的定向调控。EC 对剪切应力的响应涉及重塑肌动蛋白细胞骨架的多种信号通路的激活，从而促进 EC 的迁移。在血管生成萌芽期间控制 EC 行为的各种信号通路中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号在调节血管生成中起着至关重要的作用。最近，MAPK 信号被证明与血管重塑和发芽有关。

最近，在四川大学华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室课题人员的一项工作中，初步研究了不同血流模式（生理LSS：15 dyn/cm2；促动脉粥样硬化血流DSS：0.5 ± 4 dyn/cm2）对体外血管生成的影响，探讨了不同血流模式下内皮血管生成的变化及其潜在机制。研究结果显示，通过 MIEN1-ERK/MAPK 信号转导轴，扰动流显著损害了 ECs 的血管生成。这些结果为扰动剪切应力对血管生成的影响提供了直接的见解。详细研究成果发表在 The Journal of Cellular Physiology 期刊题为“Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis”。

首先，研究了响应不同 FSS 模式的血管样结构的形成，发现与扰动流相比，层流中形成的 HUVECs 的血管样结构更多。VEGF 被认为是血管生成的重要介质，能够刺激血管生成萌芽，包括 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 VEGFD 多种亚型，因此，检测了四种亚型的 mRNA 和蛋白质表达。结果表明，与 LSS 相比，DSS 中 VEGFB mRNA 水平下调，而 VEGFA、C 和 D 的 mRNA 表达显著增加。蛋白质检测结果显示，与 LSS 相比，DSS 中 VEGFB 的表达较低，而两组之间的 VEGFA、C 和 D 表达无显著差异。免疫荧光分析证实，与 LSS 相比，DSS 下 HUVECs 的细胞质和膜区域中的 VEGFB 分布显著降低（图1 f、g）。

进一步探究 VEFGB 对 FSS 的影响，用 10 ng/mL VEGFB 诱导后，可以发现 ECs 在扰动流条件下倾向于形成血管样结构（图1 h）。定量分析证实，诱导扰动组的血管小管和肾小管面积相对对照组增加（图1 i）。相反，静态组和层流组在有或没有 VEGFB 处理的情况下没有差异。这些结果表明，DSS 通过降低 HUVECs 中 VEGFB 的表达来破坏血管生成过程。

图1 Matrigel上 HUVECs 的血管生成响应不同模式的 FSS。

接下来，为了探究剪切应力诱导血管生成的机械转导机制，实验重点关注了不同流动模式条件下细胞膜和细胞骨架的变化。结果发现，HUVECs 中响应 DSS 的基因数量减少，特别是 MIEN1 在 DSS 中的 mRNA 和蛋白水平均显著降低。通过免疫荧光探索 HUVECs 中 MIEN1 的分布（图2 e、f），观察到 LSS 组中大量 MIEN1 高表达。此外，MIEN1 在 HUVECs 中呈点状分布，主要分散在 LSS 组的细胞质和膜区域。

为了研究 MIEN1 在剪切应力介导的血管生成中的作用，用 MIEN1 siRNA 转染 HUVECs 降低 MIEN1 蛋白的表达（图2 a、b、c）。上述结果表明，DSS 导致 HUVECs 中 VEGFB 的 mRNA 和蛋白质表达降低。因此，接下来确定 MIEN1 是否是 VEGFB 表达所必需的。数据证实，si-MIEN1 减弱了 VEGFB 的表达，进一步突出了 MIEN1 在此过程中的重要性（图2 b、d）。同时，进行 MIEN1 的过表达也证实了上述结果，显示 MIEN1 的上调显著增强了 VEGFB 的表达。

研究证实，暴露于 LSS 的 ECs 表现出比 DSS 更高的 F-肌动蛋白表达水平。因此，研究了不同流动条件下 HUVECs 中微丝的分布。暴露于层流中，HUVECs 显示出明显且明确的丝状 F-肌动蛋白结构，然而在扰动流下，F-肌动蛋白出现分散。随后使用 si-MIEN1 敲低 MIEN1，发现 LSS 和 DSS 组内细胞骨架组织都受到干扰（图2 e）。此外，MIEN1 的降低扰乱了细胞骨架在微丝（F-肌动蛋白束）形成中的组织（图2 g）。定量分析显示，与 LSS 组相比，DSS 组中 F-肌动蛋白的荧光强度降低（图2 f）。一般来说，DSS 破坏了细胞骨架的结构完整性。然而，MIEN1 过表达组在 DSS 条件下表现出增强的细胞骨架组织能力。

随后，探讨了 MIEN1 在血管生成中的作用。在 LSS 组中，用 si-MIEN1 转染明显抑制了血管样结构的形成（图2 h）。在层流条件下，血管连接处和肾小管面积均降低（图2 i）。有趣的是，与 DSS 相比，MIEN1 的过表达促进了细胞中血管样结构的形成。这些结果表明，DSS 通过调节细胞骨架排列和降低 MIEN1 来损害内皮血管生成。

图 2 MIEN1是剪切应力调节血管生成所必需的。

实验探索了响应 LSS 和 DSS 的细胞质信号通路的改变，通过热图对响应不同剪切应力的细胞质信号转导相关基因进行聚类，发现与 LSS 相比，DSS 诱导的 HUVECs 中 MAPK 信号的降低最为显著，且 p-ERK、p-MEK 和 p-p38 的表达显著降低。然后，使用选择性 ERK 抑制剂 SCH772984 研究了 ERK/MAPK 信号在 HUVECs 血管生成中的参与。结果表明，SCH772984 有效地降低了 p-ERK 的表达。在静态和流动条件下，SCH772984 处理使血管生成能力明显减弱。这些发现表明，剪切应力介导的 ERK/MAPK 信号积极参与血管生成，DSS 通过下调 ERK/MAPK 信号阻碍内皮血管生成。

此外，实验发现 p-ERK 在细胞中广泛分布，特别是在 HUVECs 的细胞核中。有趣的是，与静态组和 DSS 组相比，LSS 组表现出更高的 p-ERK 核分布（图3 a）。荧光定量显示，LSS 组中 p-ERK 的核积累增加，DSS 组中的核积累减少（图3 b）。与静态条件相比，LSS 下 HUVECs 中 p-ERK 的总水平显著增加 193.2%，然而，当将 DSS 组与 LSS 组进行比较时，这一水平下降到 55.5%（图3 c）。研究人员发现，FSS 通过细胞膜上的 MIEN1 诱导细胞质信号传导。si-MIEN1 可有效抑制 p-ERK 表达（图3 d、e），而在 si-MIEN1 HUVECs 中ERK 没有变化（图3 d、f）。免疫荧光染色进一步证实，敲低 MIEN1 可降低 HUVECs 中的 p-ERK 表达（图3 g、h）。这些结果表明，MIEN1 触发内皮血管生成中的ERK/MAPK信号。

图3 MIEN1在内皮血管生成中触发ERK/MAPK信号。

图4 示意图阐明了DSS通过抑制MIEN1-ERK/MAPK信号轴损害HUVECs的血管生成。直动脉暴露于层流（LSS），而在分支或弯曲血管中，血流受到干扰（DSS）。血液流动中的ECs经历机械感应和细胞质信号变化（ERK/MAPK信号），改变VEGFB表达，从而影响血管生成。DSS 相对于 LSS 会破坏血管生成。

总之，在这项工作中，研究人员提供了强有力的证据，证明血管生成受到不同剪切应力模式的显著影响。血流流动中的 ECs 通过 MIEN1 和细胞骨架重塑进行机械传感，导致细胞质信号激活（ERK/MAPK信号），从而改变 VEGFB 的表达，调节血管生成。这些发现为响应剪切应力的血管生成的细胞生物物理变化提供了宝贵的见解。

参考文献：Cheng L, Shi H, Du L, Liu Q, Yue H, Zhang H, Liu X, Xie J, Shen Y. Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis. J Cell Physiol. 2024 Jan 12. doi: 10.1002/jcp.31177. Epub ahead of print. PMID: 38214132.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38214132
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