Naturethink剪切力|细胞切应力|流体剪切应力|细胞流体剪切力|fluid shear stress|细胞体外培养|仿血流剪切应力培养系统

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，可导致心绞痛、心肌梗塞或缺血性中风。血管内皮细胞（ECs）在动脉粥样硬化发展初期到晚期阶段起着核心作用。内皮极性是维持内皮稳态功能所必需的，包括剪切应力调节的机械转导以及抗凝血作用和屏障功能。内皮极性的丧失导致通透性和白细胞募集的增加，并导致动脉粥样硬化的发展。

细胞极性是指某些细胞质成分在空间顺序上的分布不均匀，导致细胞器和细胞骨架等细胞成分组织不对称。细胞极性主要有两种类型，第一种类型是顶-底极性（ABP），另一种类型是平面极性（PCP）。平面细胞极性指极性细胞沿着一个共同的平面统一排列（上皮细胞平面细胞极性与顶端-基底的极性垂直）。越来越多的研究表明，内皮极性受流动剪切应力（FSS）的调控，而层流剪切应力（LSS）促进内皮PCP的形成。然而，振荡剪切应力（OSS）对内皮PCP的影响尚不清楚。

TET1（10-11 转位蛋白1）是催化 DNA 去甲基化的关键蛋白，主要在早期胚胎细胞中高表达。TET1 的截短异构体——TET1s，其蛋白结构缺失 CXXC 结合域，广泛在成体组织表达，并有研究指出 TET1s 通过非 DNA 去甲基化途径调控基因表达。

重庆大学生物工程学院、生物流变科学与技术教育部重点实验室王贵学教授、邱菊辉研究员课题组在之前的研究表明，TET1s参与保护血管内皮屏障，其表达受不同剪切应力的调节。在进一步的深入研究中，该课题组又在体内和体外实验中，探讨了 TET1s 在 FSS 对内皮细胞 PCP 的调节中的作用。相关研究成果发表在 APL Bioengineering 期刊题为“Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization”。

振荡剪切应力诱导的TET1s下调通过抑制肌动蛋白聚合损害血管内皮细胞平面细胞极性

首先，在大鼠主动脉弓内弯施加OSS（5 dyn/cm²），在胸主动脉施加LSS（12 dyn/cm²）刺激ECs，通过比较主动脉弓和胸主动脉的内皮形态学差异，探讨OSS对ECs PCP的影响。与胸主动脉ECs相比，主动脉弓内弯的ECs伸长率降低、核椭圆度降低、细胞密度增加。

细胞骨架（微管/MT 和微丝/F-肌动蛋白）的分布和排列是 ECs 中 PCP 的重要特征。与胸主动脉的ECs相比，主动脉弓内弯的ECs长轴上游的微管组织中心（MTOC）显著增加，两侧显著降低，下游无差异。然后研究了肌动蛋白细胞骨架的重排。结果表明，胸主动脉ECs中含有大量平行于细胞长轴排列的F-肌动蛋白，且大部分横贯细胞。相比之下，主动脉弓 ECs 沿细胞边缘呈圆形的 F-肌动蛋白线，细胞中仅存在少量长度较短的 F-肌动蛋白（图1 a）。血流诱导的极化ECs高尔基体主要位于核长轴上游，是PCP的标志。通过免疫荧光观察高尔基体在主动脉弓和胸主动脉内弯的ECs中的细胞内定位，发现高尔基体主要分布在核长轴的上游和两侧，少数高尔基体分布在胸主动脉ECs的下游，主动脉弓内弯ECs上游的高尔基体明显减少，而两侧的高尔基体明显增加。

这些结果表明，与LSS相比，OSS在体内抑制了血管内ECs中的PCP。

图1 C57BL/6J小鼠（WT小鼠）胸主动脉和主动脉弓内皮细胞f -肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色和表面。

为了进一步研究OSS对内皮PCP的影响，HUVECs通过体外平行板流室装置暴露于LSS或OSS 48小时，观察不同剪切应力刺激的ECs的形态变化。结果表明，与LSS相比，在OSS条件下细胞伸长受到显著抑制。

然后研究了不同剪切应力对HUVEC细胞骨架（包括微管和微丝）的影响。与LSS刺激的HUVECs相比，OSS显著增加了MTOC在细胞核长轴上游的分布，但降低了核两侧的分布。体外培养的微丝的形态与体内相似。LSS刺激的HUVECs含有大量的F-肌动蛋白，平行于细胞的长轴排列，且大部分F-肌动蛋白也横穿细胞。相比之下，OSS 刺激的 HUVECs 沿细胞边缘呈环形 F-肌动蛋白带，细胞中也存在少量长度较短的 F-肌动蛋白.在体外，与LSS相比，高尔基体更有可能分布在暴露于OSS的HUVECs中细胞核长轴的两侧。这种现象在体外比在体内更明显。

这些结果表明，OSS在体内和体外均抑制血管内皮细胞PCP。

接下来，为了研究不同剪切应力对ECs中TET1s表达的影响，将HUVECs暴露于LSS或OSS中48 h。免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，与LSS相比，OSS组的TET1s表达水平显著降低。这些结果表明，OSS抑制了ECs中TET1s的表达。

为了检验 TET1 的降低是否是 OSS 诱导的内皮 PCP 损伤的关键因素，研究人员构建了一种 TET1s 过表达的腺病毒来转染暴露于 OSS 的HUVECs（图2 a、b）。与对照（NC）组相比，过表达TET1s（OE）组的细胞伸长率显著增加（图2 c、d）。然而，核椭圆度没有显著变化，它可能是由与流动相关的其他通路调节的，而不是由TET1s调节的。

此外，还测试了TET1s过表达对暴露于OSS的HUVECs中内皮细胞骨架和高尔基体定位的影响。在TET1s过表达的HUVECs中，F-肌动蛋白的数量和长度显著增加，且大部分F-肌动蛋白平行于血流方向，而MTOC和高尔基体相对于细胞核的定位没有差异。

这些数据表明，TET1s过表达可以挽救OSS抑制的内皮PCP。

图2 过表达的 TET1 挽救了 OSS 抑制的内皮 PCP。

因为内皮微管和高尔基体的定位和分布没有明显受到影响，因此，重点研究了TET1s对微丝的影响。结果显示，敲除TET1s的表达降低了LSS诱导的HUVECs中F-肌动蛋白聚合的数量和长度，并且平行于流动方向的F-肌动蛋白的排列也显著降低。通过比较小鼠TET1−/− 和TET1cs/cs 之间胸主动脉 ECs 的差异，发现TET1s的缺乏降低了F-肌动蛋白的聚合率和长度。

分泌型卷曲相关蛋白-1（sFRP-1）调节 EC 细胞骨架重组，其表达受表观遗传途径调控。为了进一步探讨TET1s参与内皮PCP调控的机制，对TET1−/−小鼠和TET1CS/CS小鼠血浆中sFRP-1水平进行ELISA检测，发现TET1s缺失可显著降低血浆sFRP-1水平，RT-qPCR检测发现TET1s的缺失可显著降低sFRP-1的mRNA水平。相反，在体外，暴露于 OSS 的 HUVECs 中过表达的 TET1s 增加了sFRP-1 的表达和分泌。

ECs高度表达Fzd家族成员卷曲蛋白4（Fzd4），并已证实sFRP-1/Fzd4调节细胞骨架重组。通过免疫沉淀技术，实验证实了OSS显著降低了sFRP-1/Fzd4的相互作用。然而，TET1s 的过表达部分恢复了 OSS 抑制的 sFRP-1 与 Fzd4 的相互作用。

为了确认 sFRP-1/Fzd4 信号通路参与 TET1s 诱导的 F-肌动蛋白聚合，将 sFRP-1 干扰质粒转染到过表达的 TET1s HUVECs中，从而敲低 sFRP-1 的表达（图3 a-c），结果表明，敲低 sFRP-1 表达损害了 TET1s 诱导的 F-肌动蛋白聚合（图3 d、e）。

这些数据表明，TET1s的缺乏损害了LSS诱导的内皮细胞PCP，SFRP-1/Fzd4介导TET1S诱导的F-肌动蛋白聚合。

图3 敲低 sFRP-1 阻断 TET1s 诱导的内皮 F-肌动蛋白聚合。

上述已经证明 TET1s 促进 ECs 中 sFRP-1 的表达，但其机制尚不清楚。最后，实验研究了TET1s是否通过DNA去甲基化促进ECs中sFRP-1的表达，通过dot-blot实验检测了暴露于OSS的过表达TET1s HUVECs的整体DNA甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）水平。结果表明，过表达的TET1s不会导致整体DNA甲基化和羟甲基化水平的变化。采用DNA免疫沉淀-qPCR分析CpG岛的羟甲基化水平，结果表明，过表达的TET1s增加了sFRP-1基因启动子的第二个CpG岛的羟甲基化水平。此外，TET1s显著降低了sFRP-1基因启动子的第二个CpG岛的甲基化水平。这些结果表明，TET1s的过表达介导了sFRP-1基因启动子的去甲基化。

因此，这些结果表明，TET1s是FSS诱导的内皮PCP调节的关键因素。该调节是通过改变 sFRP-1 启动子的去甲基化，从而影响 sFRP-1/Fzd4 的相互作用，并最终介导 F-肌动蛋白。

综上所述，该研究表明，TET1s 参与调节 FSS 诱导的内皮 PCP 变化。TET1s 促进 sFRP-1 启动子区域的 sFRP-1 去甲基化水平。作为EC细胞骨架重组的调控因子，sFRP-1的高表达通过sFRP-1/Fzd4信号通路导致F-肌动蛋白聚合，从而诱导内皮PCP。这些发现不仅扩展了我们对TET1s在OSS诱导的PCP损伤中的作用的理解，而且可用于OSS驱动的血管疾病的潜在治疗。

参考文献：Qu K, Wang C, Huang L, Qin X, Zhang K, Qiu J, Wang G. Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization. APL Bioeng. 2023 Jul 31;7(3):036104. doi: 10.1063/5.0141289. PMID: 37533755; PMCID: PMC10393427.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37533755/

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