振荡剪切应力诱导的EPCs外泌体circ_1199在EPCs间质转化及病理性血管重构中的作用及机制

研究表明，内皮-间充质转化（EndoMT）参与病理性血管重塑过程。作为内皮细胞的前体细胞，内皮祖细胞（EPCs）EndoMT也是病理性血管重塑的常见机制。此外，振荡剪切应力（OSS）促进了EPC EndoMT。EPCs暴露于OSS后，内皮细胞标志物VE-钙粘蛋白和CD31的表达下调。同时，间充质细胞标志物α-SMA和SM22α的表达显著增加。因此，潍坊医学院基础医学院、淄博市中心医院转化医学中心的一项研究探讨了OSS诱导的EPC EndoMT的机制，以期进一步阐明OSS对EPC EndoMT的影响以及病理性血管重塑的发生和发展。

外泌体（Exos）是具有完整膜结构（直径30-150nm）的纳米级细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。Exos被认为是细胞-细胞通讯的重要介质，参与许多生理和病理过程。在这项研究中，研究人员发现OSS处理的EPCs释放的Exos（OSS-Exos）可以诱导EPC EndoMT。但内部机制有待进一步探讨。

最近，Exos中的环形RNAs（circRNAs）引起了广泛的关注。CircRNAs具有共价闭环结构。新出现的证据表明，外泌体circRNAs在复杂的人类病理学中起着重要作用。此外，circRNAs可以充当miRNA分子的“海绵”，抑制miRNA与靶基因mRNAs的结合，从而促进靶基因的转录。

该团队使用高通量测序技术研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表达谱。基于生物信息学分析和实验验证，发现circ-1199被OSS显著上调并明显加载到Exos中。然而，OSS诱导的EPC EndoMT是否由外泌体circ-1199介导目前尚不清楚。该研究旨在探讨 Exos 和外泌体circ-1199对EPC EndoMT的影响和可能机制。

从 OSS 处理的 EPCs 灌流液中分离的Exos诱导 EPC EndoMT

EPCs分泌的Exos影响血管细胞和组织功能，实验首先确定了Exos是否参与OSS（±3.5 dyne/cm2，1 Hz）诱导的EPC EndoMT。从细胞上清液（Static-Exos）或灌流液（OSS-Exos）中分离Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表达CD9、CD81和CD63，它们是Exos的代表标志物。

为了评估OSS-Exos对EPC的影响，PKH26标记的Exos与EPCs的共培养，发现这些Exos被EPCs有效地吸收（图1 D）。EdU测定结果表明，OSS-Exos显著增加了EPCs的增殖（图1 E）。RT-qPCR和WB结果显示，OSS-Exos下调内皮标志物CD31和VE-钙粘蛋白的表达，上调间充质细胞标志物α-SMA和SM22α的表达（图1 F、G）。这些数据表明，OSS-Exos在EPCs中诱导了EndoMT。

图1 OSS-Exos诱导EPC增殖和EndoMT。

Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 处理的 EPCs 中显著上调

通过高通量RNA测序筛选用OSS处理的EPCs中表达的circRNAs。如图2 A-B所示，基于生物信息学分析，选择circ-1199作为靶向circRNA。接下来，通过RT-qPCR证实了circ-1199在OSS 加载的EPCs中的表达。结果表明，当EPCs加载OSS持续 3、6、12、24 h时，circ-1199在6 h后增加，并在24 h内保持较高水平（图2 C）。此外，RNA FISH表明EPCs在静态状态下很少表达circ-1199，但在OSS加载后circ-1199阳性细胞数量明显增加（图2 D）。

接下来，进行RT-qPCR和RNA FISH测定以测量Exos中circ-1199的表达。RT-qPCR结果显示，OSS-Exos中circ-1199的水平高于静态-Exos（图2 E）。RNA FISH结果表明，当Exos与EPCs共培养时，OSS-Exos处理的EPCs中circ-1199的表达高于静态-Exos处理的EPCs（图2 F）。

图2 Circ-1199在用OSS处理的EPC中异常表达。

Circ-1199 促进了 EPC EndoMT

为了评估circ-1199对EPC EndoMT的影响，将circ-1199过表达慢病毒载体（LV-circ-1199）转染到EPCs中。结果表明，用LV-circ-1199转染EPCs后，circ-1199的表达明显上调，增殖明显增加。此外，内皮细胞标志物VE-钙粘蛋白和CD31的表达降低，而间充质标志物α-SMA和SM22α的表达在基因和蛋白质水平均上调。这些结果与用OSS-Exos处理的EPCs的结果一致。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 参与 EPC EndoMT

新兴研究表明，circRNAs的主要机制是作为miRNA的海绵，从而释放miRNAs对靶基因的抑制作用。然后，实验预测了miRNAs和circRNAs之间的结合位点。结果表明，circ-1199具有两种类型的miRNAs（miR-520f和let-7g-5p）的结合位点，let-7g-5p表现出更多的结合位点。同时，获得了94个靶基因作为let-7g-5p候选基因，其中HMGA2得分最高。双荧光素酶报告基因测定显示，circ-1199有效结合let-7g-5p（图3 C），let-7g-5p也与HMGA2 mRNA的3′UTR结合（图3 D）。RT-qPCR结果表明，circ-1199的过表达降低了let-7g-5p的表达，同时增加了HMGA2的表达（图3 E）。此外，let-7g-5p模拟物（图3 F）和LV-shHMGA2（图3 G）都下调了EPCs中α-SMA和SM22α的表达。

有趣的是，用OSS-Exos处理EPCs后，circ-1199的表达增加（图3 H）。同时，let-7g-5p的表达降低（图3 I），HMGA2显著增加（图3 J）。WB结果证实了HMGA2的上调表达（图3 K）。

这些结果表明，OSS-Exos可以上调circ-1199，从而可能发挥分子“海绵”的作用吸附let-7g-5p，从而增加HMGA2的表达。

图3 Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA参与EPC EndoMT。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 调节 EPC 转录因子 Smad3 和 Snail

据报道，多种信号通路，如TGF-β/Smad信号、Wnt/β-连环蛋白信号和Notch信号通路，都参与了EndoMT的转录调控。研究表明，HMGA2上调TGF-β/Smad信号通路中Snail、Twist 和Slug 的表达，从而导致上皮细胞中上皮到间充质的转化（EMT）。因此，实验进一步研究了转录因子Smad3和Snail是否参与EPCs的EndoMT过程。WB结果表明，OSS-Exos处理EPCs后，p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表达明显上调。

为了进一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相关转录因子的机制，在用LV-circ-1199，let-7g-5p模拟物或LV-shHMGA2预处理EPCs后测量了HMGA2，p-Smad3 / Smad3和Snail的表达。结果表明，经LV-circ-1199、let-7g-5p模拟物和LV-shHMGA2处理后，HMGA2、p-Smad3/Smad3和Snail 的表达均上调。然而，let-7g-5p模拟物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2，p-Smad3/Smad3和Snail的表达。

这些结果表明，circ-1199–let-7g-5p–HMGA2参与了EPCs中OSS-Exos诱导的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活。

OSS-Exos 和 circ-1199 在体外和体内都损伤了 EPCs 的血管生成

血管生成能力是EPCs的重要功能。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的标志性事件。为了进一步研究OSS-Exos对EPC功能的影响，实验在体外评估了血管生成。结果表明，OSS-Exos组EPC血管生成显著降低（图4 A）。此外，用LV-circ-1199转染后，EPCs的血管生成能力也明显降低（图4 B）。

接下来，使用Matrigel plug 测定法来测定小鼠体内EPCs的血管生成。结果表明，用OSS-Exos处理的EPCs形成较少的血管样结构（图4 C）。此外，在OSS-Exos处理的EPCs中，CD31和vWF的表达降低（图4 D），α-SMA和SM22α的表达增加（图4 E）。

此外，与对照组相比，用LV-circ-1199处理EPCs后，血管状结构的数量减少（图4 F）。同时，内皮标志物CD31和vWF的表达降低（图4 G），但间充质标志物α-SMA和SM22α的表达明显增加（图4 H）。

图4 OSS-Exos和circ-1199在体外和体内都损害了EPCs的血管生成。

图5 在Exos circ-1199处理后 EPC EndoMT的机制。

综上所述，在OSS-Exos中富集的circ-1199促进EPC EndoMT并作为let-7g-5p的分子海绵，从而上调HMGA2的表达。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能参与这个过程（图5）。

参考文献：Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36435223/

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