提高细胞培养的生理相关性：体外共培养模型的可能性、考虑因素和未来方向

近年来，在肌肉生理学研究中使用体外模型，可以对细胞生长和萎缩的细胞内机制进行有价值的研究。尽管药理学诱导的生长和萎缩模型突出了进一步研究的关键目标，但转化为体内人体工作可能有限。这可能部分是由于基础培养条件。永生化的骨骼肌细胞系（如C2C12）常规使用Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）进行培养，并补充有动物源性血清，即胎牛血清（FBS）用于增殖和马血清用于分化。尽管这种组合提供了支持细胞生长的最佳要求，但这些培养基配方中存在超生理剂量的营养物质。因此，传统的细胞培养模式创造了一个缺乏生理相关性的微环境，这使得体外实验的有效性和任何发现对人类的适用性受到质疑。

毫无疑问，有人类参与者的体内实验为研究肌肉生长、萎缩的机制和对营养保健品和药理化合物的潜在健康促进反应的机制提供了金标准方法。然而，由于伦理考虑和技术挑战性，越来越多的人需要开发一种更生理相关的体外模型来研究肌肉生长和萎缩，这种模型可能更好地转化为人体模型。此外，这种离体方法允许对某些系统环境的影响进行有价值的研究，例如衰老，慢性疾病和营养质量，从而为研究受不同队列和营养刺激影响的分子途径提供更多的生理基础。

在英国伯明翰大学体育、运动和康复科学学院、威斯敏斯特大学生命科学学院，爱尔兰利默里克大学体育教育和运动科学系团队的一项新报告中，概述了目前在体外共培养模型中使用离体人血清和血浆的理解和方法，特别关注来自永生化细胞系和原代细胞培养物（即分别为C2C12和HSMC）的骨骼肌细胞的使用，还讨论了关键的方法论和未来方向，以提供该模型的基本原理和潜在应用，以实现更广泛的研究人员使用该方法的标准化，相关内容发表在 AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-CELL PHYSIOLOGY期刊题为“Improving physiological relevance of cell culture: the possibilities, considerations, and future directions of the ex vivo coculture model”。

历史观点和当前模型进展

体外共培养模型的灵感来自于先前建立的异种共生模型。同样，体外共培养模型利用离体血清和血浆作为预处理，或在培养中完全替代动物血清，以研究对不同系统环境暴露的反应。事实上，早期利用人血清共培养模型的研究旨在比较不同细胞类型的增殖和分化能力，如人骨髓间充质干细胞（hMSCs）和基质细胞，在与FBS进行比较的情况下，与人血清培养的反应。这些早期研究的首要目的是减少由于批次间差异和异种蛋白的免疫效应而在培养中使用的FBS。调查这种方法的首批研究之一显示，与使用FBS的标准方案相比，与人血清一起孵育的hMSCs的增殖速度加快。此外，已经确定人血浆和血清之间人成纤维细胞和脂肪组织来源干细胞的群体倍增时间没有差异，突出了在共培养中除血清外还可利用血浆的潜力。

最近，离体血浆和血清已被用于骨骼肌细胞的共培养。这些包括永生化的细胞系，如C2C12、L6、LHCN-M2和HSMC，以研究细胞内信号传导对各种治疗的反应。最早利用肌肉细胞离体模型的研究之一涉及培养来自年轻和老年供体的HSMC。研究发现，来自年轻和老年供体的血清在组间用2%人血清处理的HSMC中诱导的增殖和分化没有变化。这表明来自不同年龄组的血清可能不会在共培养模型中诱导可检测到的变化。相比之下，C2C12骨骼肌细胞的初步工作提供了更有希望的结果。因此，C2C12和LHCN-M2永生化骨骼肌细胞系联合人血清或血浆处理可能为研究细胞信号传导提供了合适的替代模型。近年来，该模型已扩展到研究各种系统环境的影响，包括损伤、衰老、疾病、营养来源和运动。

肌肉细胞体外共培养模型的建立

代谢生理学中体外共培养模型的发展在很大程度上是由提高体外研究结果到体内人体试验的转化的愿望所驱动的。因此，需要更多生理性相关的体外模型来提供一个平台，可以试验新的营养物和药物治疗的有效性。目前，体外模型已被用于研究饲喂后不同营养源的合成代谢特性。Carson实验室的初步工作检查了离体模型是否可用于检测C2C12中合成代谢信号的差异。这些研究强调了该模型在研究蛋白质合成代谢响应不同质量蛋白质的能力，这是由于对替代可持续蛋白质来源的需求不断增长而取得的重要进展。

除了营养供应外，运动和体育活动还支持肌肉维护和适应性重塑，并可以改善整个生命周期的健康。尽管运动很重要，但目前只有一项研究使用永生化的人类骨骼肌细胞系（LHCN-M2）来调查不同运动受试者血清的影响。在这项研究中，从练习排球、足球、游泳或健身至少3年、180分钟/周的参与者中，在训练后8-10小时收集血清，结果表明，来自运动个体的血清是一种可行的模型，用于研究运动在培养中的有效性。然而，需要进一步的研究来评估阻力与耐力运动后获得的血清的影响，以研究组织重塑的潜在驱动因素，例如细胞外囊泡（EVs）的作用。这可以为研究体外运动提供替代电脉冲刺激（EPS）的模型。然而，这种方法将消除机械刺激的影响，机械刺激是与体内肥大相关的影响因素。因此，更合适的方法可能包括在EPS之前对血清/血浆中的肌肉细胞进行共培养。

总的来说，体外共培养模型已被用于研究骨骼肌细胞系和原代骨骼肌细胞中的不同系统环境。尽管许多实验室已采用人血清或血浆来调节培养基，但目前尚无一致的方法可用于纳入离体人血清和/或血浆样本，因此这方面的进展受到限制。

肌肉细胞体外共培养模型的实际考虑

系统性考虑

在肌肉细胞的体外共培养模型的发展中，血浆和血清已被用于研究不同系统环境的影响（图1）。正确使用离体模型需要考虑许多因素，包括血液成分（即血浆与血清）和剂量的选择。由于血浆和血清中许多关键化学分析物（如葡萄糖）的浓度相似，因此有理由认为两者可以互换用于培养。然而，血浆已被证明会导致活力问题，可能是凝血因子和纤维蛋白原存在的结果。事实上，先前研究表明，与血清相比，C2C12s对血浆的耐受性较差，分别为5%和10%-20%。此外，用于血浆收集的抗凝剂可能会影响细胞活力。先前的工作表明，在锂肝素（LH）真空容器中收集的离体血浆应该是目前离体共培养血浆的标准。

图1 离体细胞培养实验装置的示意图。在正常生长条件下维持的骨骼肌细胞（细胞系或原代人细胞）应铺板进行实验。为了评估肌管中的细胞内信号传导，在用人血浆/血清治疗之前，应让细胞分化5-7天。为了评估细胞增殖和分化的标志物，应在进行实验时完成与人血浆/血清的孵育。

实验设置：样本量、剂量和时间

除了血液成分类型外，在设计使用离体模型的实验时，还必须考虑样本量、剂量和治疗时间。根据先前研究的计算，建议使用4-6个离体样本（生物重复）进行实验，一式三份，使用三个连续的传代数来提供技术重复。

在增殖或分化过程中，通常采用合并方法进行治疗。先前使用这种方法的研究表明，需要较低剂量的血清才能在较长时间的过程中维持C2C12s或HSMC，例如分化，类似于标准培养条件（即2%马血清）。数据表明，需要较低剂量（2%-5%）的人血清来研究整个分化期间诱导的变化。未来的研究应旨在研究在终点治疗前的增殖/分化过程中以较低剂量用人血清/血浆共培养细胞的效用。

根据实验目的，为了最好地代表体内情况，研究人员可能会寻求最大化应用于培养模型的离体人血浆/血清的剂量。之前曾研究过C2C12细胞在高浓度离体人血清中的活力，发现浓度高达50% 的C2C12在短时间内（2-4小时）耐受性良好，但较低浓度（高达20%）耐受性良好长达24小时。总体而言，这种共培养模型的目的是更接近地模拟细胞在体内暴露的间质环境，并且必须认识到血清/血浆不同于间质液。

实验性对照

除了实验条件外，实验设置的一个重要组成部分是使用适当的对照。由于体外人血清/血浆的应用，通常需要比较许多不同的条件，例如，健康与患病、年轻与老年、进食与禁食，因此需要许多不同的对照。当一起使用时，这些基线条件可作为重要的对照，以了解在不同系统环境孵育后发现的任何变化是否由于治疗效果。

除了使用适当的对照外，还应考虑最合适的统计测试。例如，在调查疾病或衰老等条件之间的差异时，应选择组间统计检验。同样，如果分析中包括血清饥饿或维持在正常生长条件下的未处理对照，则应选择组间统计检验。相反，如果血清/血浆样本是在不同时间点从同一参与者获得的，例如，禁食与喂食样本，或者涉及使用血清/血浆处理，有或没有额外的营养供应或药物治疗，则应使用统计测试。

基线培养条件

除了考虑使用离体样本外，还应在整个实验设计中考虑基线培养条件。根据实验目的，培养细胞的背景或基础培养基可能对实验结果产生影响。例如，其他研究已经显示，当血清被去除时，C2C12s中的合成代谢信号传导减少，之前观察到在DMEM和血清存在的情况下，将离体人血清添加到C2C12s中反应会减弱。这可能是由于这些培养基中存在高浓度的营养物质（即EAA）和生长因子，从而导致饱和效应。其他营养因素，如高或低葡萄糖，应根据实验目的考虑。

非肌肉细胞系的注意事项

以上主要考虑了该方案在使用肌肉细胞系时提高生理学相关性的发展。然而，除了血脑屏障内的细胞，比如用运动前后的血浆刺激癌细胞的增殖外，这种方法不能用于大多数非肌肉细胞系的原因几乎没有。值得注意的是，离体共培养模型已经应用于许多非肌肉细胞系，如脂肪细胞、肝细胞和神经元细胞。

未来发展方向和新应用

正如以上所述，体外模型有潜力研究细胞内机制对多种刺激的反应，包括不同的疾病状态和营养状况。当HSMC不可用时，这可能特别重要，并在具有技术挑战性的体内试验之前提供有价值的见解（图2）。然而，未来的工作应旨在研究HSMC与C2C12骨骼肌细胞的离体血清/血浆响应信号传导是否存在差异，以消除任何潜在的“跨物种”影响并解释潜在的内在肌肉特性。此外，值得注意的是，该模型不仅限于使用人血清或血浆。最后，随着EVs在细胞通信中的新兴作用，包括肌肉对运动等刺激的反应，以及观察到FBS含有直接抑制C2C12分化的功能性EVs，未来的一个研究方向可能是EVs耗尽血浆/血清以及提取和重悬的EVs。

图2 体外和体内工作的推荐操作模型。建议体外模型应利用人原代骨骼肌细胞或永生化细胞系，例如C2C12s，协同人血清/血浆处理。体外研究的结果可用于为体内人体分析提供信息。在人类数据收集后，可以进行进一步的体外工作，以探索进一步的机制数据以及营养物质和药物治疗的有效性，以根据初步发现为以后的体内工作提供信息。

图3 图形概要

参考文献：Allen SL, Elliott BT, Carson BP, Breen L. Improving physiological relevance of cell culture: the possibilities, considerations, and future directions of the ex vivo coculture model. Am J Physiol Cell Physiol. 2023 Feb 1;324(2):C420-C427. doi: 10.1152/ajpcell.00473.2022. Epub 2022 Dec 26. PMID: 36571441; PMCID: PMC9902212.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36571441/
小编旨在分享、学习、交流生物科学等域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。
微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用。