机械应变诱导乳腺癌细胞表型变化并促进肿瘤微环境中的免疫抑制

乳腺肿瘤微环境（TME）内的机械力是癌症进展的有效调节因子。随着乳腺肿瘤的生长，各种生物力学在TME中积累，造成了肿瘤内部的压缩增加，外围张力增加以及整个肿瘤体积的间质液流动改变的复杂情况，这些力通过调控侵袭和转移级联影响癌症进展。此外，研究表明，生物力学力通过癌细胞-免疫细胞信号串扰调节免疫反应。

尽管TME内存在多种细胞-细胞信号传导机制，但外泌体在调节肿瘤进展中发挥了关键作用，可以通过调节免疫细胞活性来促进癌细胞免疫逃逸，从而促进易于肿瘤发展的环境。此外，研究表明，生物力学力可能具有通过TME内外泌体介导的信号传导直接或间接调节细胞成分的潜力。

有几种仿生体外系统可用于确定机械力对癌细胞的影响。微流体和Transwell系统通过调节趋化因子和蛋白质表达提供了对血流介导的乳腺癌（BCa）细胞信号传导的见解。其他采用压缩的体外系统已显示，BCa细胞响应压缩力通过细胞骨架重排增强其迁移。恒定张力下的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系通过FAK-Rho-ERK介导的信号增强其增殖和侵袭潜力。虽然这些体外研究已经解决了恒定流量或恒定细胞张力如何直接影响癌细胞，但尚未解决这些机械力是否有助于体内免疫抑制。此外，恶性BCa细胞中的机械力，外泌体释放和免疫反应之间的直接联系尚未得到研究。

来自美国阿拉巴马大学伯明翰分校医学系、病理学系、机械工程系课题组的一项研究曾报告了机械应变能明显改变BCa细胞的蛋白质组学特征并能增强外泌体的产生，所产生的外泌体能够直接促进恶性肿瘤细胞的生长，并诱导肿瘤微环境中的免疫抑制及改变免疫细胞的极化。相关研究成果发表在Laboratory Investigation期刊，题为“Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment”。

振荡应变促进BCa细胞增殖和迁移

首先，为了确定体外机械应变是否调节BCa细胞的增殖，利用体外张力系统，参数为0.3 Hz，10%单轴振荡应变（Oscillatory strain，OS） 48小时，10% 恒定应变（Constant strain，CS）48小时，或无应变48小时，然后将MCF-7细胞（人ER+），MDA-MB-231细胞（人TNBC）和4T1.2细胞（小鼠TNBC）暴露于恒定或振荡应变，并评估细胞增殖。结果表明，暴露于OS的MCF-7细胞与对照细胞或CS细胞相比增殖增加（图1 a）。与对照细胞相比，暴露于CS和OS下的MDA-MB-231和4T1.2细胞的增殖都有所增加（图1 b-c）；暴露于OS增强了ER+和TNBC（人和小鼠）细胞的迁移潜力（图1 d-f）；暴露于CS仅增加人TNBC细胞的Transwell迁移和伤口愈合（图1 e）。这些数据表明，振荡应变促进ER+和TNBC细胞的增殖和迁移。

图1 BCa细胞的增殖和迁移响应机械应变而变化。

机械应变改变BCa细胞产生的外泌体

为了研究机械应变是否调节BCa细胞的外泌体产生，将MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞和4T1.2细胞暴露于OS 48小时，并从条件培养基中分离肿瘤来源的外泌体（TEXs）。 结果表明，OS暴露的人和小鼠TNBC细胞的条件培养基中的外泌体浓度显著高于对照细胞，而OS不会改变ER+ 细胞的TEX产生，而且外泌体之间的平均大小在组间没有显著差异。此外，外泌体浓度与暴露于OS后在人和小鼠TNBC细胞中观察到的增殖增加呈正相关。

目前尚不清楚增加的外泌体产量是否导致更高的增殖，或者更高的增殖是否导致外泌体的产生增加。为了解决这个问题，进行了共培养实验，将暴露或不暴露于OS 48小时的 MCF-7细胞，MDA-MB-231细胞和4T1.2细胞在存在或不存在源自癌细胞外泌体的情况下共培养，评估细胞增殖。结果没有观察到与来自对照细胞的外泌体共培养和与来自暴露于OS癌细胞的外泌体共培养之间的癌细胞增殖显著差异。因此，外泌体产生的增加不会导致更高的增殖，这表明更高的增殖可能导致研究中注意到的外泌体产生的增加。

振荡应变改变BCa细胞的免疫调节外泌体谱

Tetraspanins、CD63、CD81、CD9 和 ESCRT-I 复合物亚基TSG101 是公认的标志物，可共同识别来自其他类型细胞外囊泡（EVs）的外泌体。暴露于OS的MCF-7细胞释放的TEXs的表征显示CD63+ 外泌体的频率增加，CD81+ 外泌体的频率降低。人和小鼠TNBC细胞产生的外泌体的Tetraspanin谱没有显著变化。此外，免疫调节蛋白（如免疫检查点PD-L1）和赋予外泌体侵袭潜力的蛋白（如EpCAM和CD54）在外泌体上的存在开始在促进免疫抑制、肿瘤侵袭和转移方面受到重视。当评估这些标志物时，暴露于OS的小鼠4T1.2细胞CD81+ PD-L1+ 和CD63+ PD-L1+ 外泌体的数量增加，而CD63+ CD54+ 外泌体的数量降低。这些发现表明，振荡应变调节TNBC细胞产生PD-L1+ 外泌体。

振荡应变促进TNBC原位模型中的肿瘤生长

接下来，为了确定OS是否促进体内肿瘤生长，利用BCa的同源原位小鼠模型来监测肿瘤大小和免疫细胞的浸润。如图2 a，与移植未应变的细胞相比，移植4T1.2细胞的小鼠暴露于OS在第8天和第11天显示肿瘤生长显著增加。

由于异质性髓源性抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞具有肿瘤促进功能，并且是肿瘤相关免疫抑制的驱动因素，因此进一步研究了机械应变诱导的肿瘤细胞变化是否改变了乳腺TME以调节这些免疫抑制细胞的浸润，从而进一步促进肿瘤生长。肿瘤组织的免疫分析显示，移植4T1.2细胞的小鼠暴露于OS在第14天TME中单核细胞MDSC亚群的百分比显著增加（图2 b）。肿瘤浸润性粒细胞在两组间的 MDSC 亚群无差异（图2 c）。此外，移植4T1.2细胞的小鼠暴露于OS后TME中募集的巨噬细胞的浸润增加（图2 d）。值得注意的是，CD8+ T细胞的百分比在这些小鼠的TME中显示出下降的趋势（图2 e）。这些结果表明，振荡应变通过TME中的免疫抑制促进肿瘤生长。

图2 振荡力促进体内TME中的肿瘤生长和免疫抑制。

振荡应变通过TME中的免疫抑制细胞调节外泌体的内化

然后进一步研究肿瘤细胞来源的外泌体是否被免疫细胞内化以调节体内的免疫抑制。结果表明，在乳腺肿瘤细胞上应用OS不仅可以增强肿瘤细胞-外泌体的分泌，还可以通过MDSCs和募集的巨噬细胞内化TEXs促进MDSCs和巨噬细胞的浸润，从而调节TME中的免疫抑制。

TME中免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体内化

最后研究了TEXs是否被TME中的免疫细胞和肿瘤细胞内化。在注射外泌体后的第2天（图3 a）和第8天（图3 a），TME中免疫细胞内化的外泌体被鉴定为PKH67+ CD45+ 细胞，而肿瘤细胞内化的外泌体被鉴定为PKH67+ CD45 阴性细胞（图3 b）。此外，在外泌体注射后第2天和第8天，在TME中检测到各种免疫细胞的外泌体内化，包括募集的巨噬细胞（图3 c）、M2巨噬细胞（图3 d）、MDSCs（图3 e-g）、 CD4+ T 细胞 （图3 h）和CD8+ T细胞（图3 i）。在外泌体+ 细胞中，MDSCs的频率高于其他研究的免疫细胞群。这些结果表明，TEXs可以被TME中的免疫细胞和肿瘤细胞在体内内化。

图3 TME中免疫细胞和肿瘤细胞内化外泌体。

总之，该研究的数据表明，暴露于机械应变会增强BCa细胞中的侵袭性和促肿瘤表型，从而通过改变肿瘤细胞的增殖和迁移潜力以及增加免疫抑制细胞内化的免疫调节外泌体的释放来促进免疫抑制，从而促进TME中增强的免疫-肿瘤细胞串扰。进一步研究参与肿瘤进展的机械应力的潜在机制的努力可能为靶向TME提供新的治疗方法。

参考文献：Wang Y, Goliwas KF, Severino PE, Hough KP, Van Vessem D, Wang H, Tousif S, Koomullil RP, Frost AR, Ponnazhagan S, Berry JL, Deshane JS. Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment. Lab Invest. 2020 Dec;100(12):1503-1516. doi: 10.1038/s41374-020-0452-1. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32572176; PMCID: PMC7686122.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32572176/

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