滑囊来源的细胞在体外对生理和病理负荷表现出明显的机械反应

众所周知，机械刺激尤其能被机械负荷高的组织细胞感知，这些组织直接负责骨骼、肌腱和肌肉的运动。对于仅间接负荷的邻近组织，这种机械响应性迄今尚未研究。其中一个相邻的组织是肩峰下滑囊（subacromial bursa），它负责减少肩袖肌腱和肩峰之间的摩擦。为了更好地理解肩峰下滑囊作为肩关节中减少摩擦的结构的生理功能，需要了解滑囊来源细胞（bursa-derived cells）的机械反应性。

与具有PDZ结合基序（TAZ）的转录共激活因子一起，YAP首先被描述为重要的机械转换器。YAP活化高度依赖于ECM刚度，而ECM刚度又受ECM成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的组成调节。非肌肉肌球蛋白II（NMM-II）是一种肌动蛋白结合蛋白，在细胞增殖、迁移和粘附中具有重要作用。此外，NMM-II对于ECM刚度的产生以及基质和剪切应力的传感至关重要。整合素作为跨膜受体将ECM连接到肌动蛋白细胞骨架上。基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制剂（TIMPs）调节各种组织的建模和重塑，MMPs和TIMPs之间的平衡对于维持组织稳态很重要。MMPs是整合素的下游靶标，其表达在机械刺激下受到调节，这在不同肌肉骨骼细胞类型的体外研究中得到了证实。研究不同机械负荷幅度对ECM形成和重塑的相关性对于了解滑囊对机械应力条件的适应非常重要。

基于此，德国柏林朱利叶斯·沃尔夫研究所、BIH再生疗法中心（BCRT）、乌尔姆大学骨科研究与生物力学研究所的一项联合研究，旨在通过研究肩峰下滑囊来源的细胞是否以及如何通过适应基质形成和重塑来响应机械应变，从而提高对其作为减少摩擦组织的生理作用的理解。低（1%），中（5%）和高（10%）应变量级已用于改进的机械加载装置。为了确认这些细胞中的机械转导过程，研究评估了YAP核易位和NMM-II的活化。作为细胞机械反应的数据，关键参数包括细胞活性，细胞骨架的方向，与ECM形成和重塑相关的标记物（Col I和III，Versican，Fibromodulin，MMPs和TIMPs）的基因表达，以及部分各自的蛋白质分泌，目标是检测机械反应的可能的生理和病理极限。目前，滑囊组织被广泛视为肩关节的被动结构。了解到这些细胞可以主动感知不同的机械应变信号并将其转导为细胞内反应，对该组织的新解释可能是必要的，并最终帮助目前肩峰下滑囊相关病变的治疗策略。

首先，实验测试了滑囊来源细胞对不同负荷条件的反应，评估了形态变化、细胞活力以及细胞取向变化。滑囊来源的细胞在体外拉伸装置下以1Hz，1%、5%和10%的机械应变幅度分别加载，发现其加载后没有明显的形态变化（图1 A）。1小时时，细胞活力在所有加载条件下均保持稳定，4小时时，细胞活力在10%幅度时趋于降低，但没有统计学意义（图1 B）。

图1 （A）从硅培养皿中B区（中间）的对照细胞和机械负荷细胞中获取的滑囊来源细胞形态的代表性图像。（B）每天机械负荷1和4小时后滑囊来源细胞的细胞活力。

与未刺激的对照组相比，1%和5%负荷组的细胞具有更致密的肌动蛋白细胞骨架，具有不同的肌动蛋白纤维，而在10%负荷下，细胞看起来更紧张，肌动蛋白密度下降，部分肌动蛋白细胞骨架破坏（图2 A）。虽然定向角度表现出很高的可变性，但从直方图中可以看出，从对照组和1%负荷组的加载角度到5%和10%负荷组的更高角度的变化（图2 B）。当研究从每个图像的平均方向计算的平均方向角时，细胞似乎在最大拉伸（0°）和最大压缩（90°）应变之间的方向上定向（图2 C），10%负荷组观察到的最高平均取向角为53.4°，与对照组（37.5°） 和1%负荷组（40.0°）相比差异显著（图2 C）。尽管取向角不同，但5%负荷组观察到最均匀的细胞取向（图2 D）。

这些数据表明，滑囊来源的细胞通过适应细胞取向对不同加载条件具有直接反应，并提示在10%负荷条件下诱导病理状态。

图2 与未刺激的对照相比，在1 Hz下，以1、5和10%的应变刺激3天，每天4小时后的滑囊来源细胞的形态和取向。（A）所有加载和控制条件下肌动蛋白丝的鬼笔环肽和 DAPI 染色的代表性z-stack 图像。（B）使用 FibrilTool 宏测量的取向角的总频率，取自来自五个个体供体（0° = 加载方向，90° = 垂直于加载方向）的硅培养皿中三个位置（a、b、c）拍摄的图像。（C）根据每个图像的平均方向计算的所有加载条件的平均方向角，并以绝对度值给出。（D）与平均取向角的平均偏差。

为了进一步证明滑囊来源细胞对机械负荷的机械反应性，接下来研究了机械转导途径，在所有刺激条件下检测YAP激活。结果表明，在 1% 和 5% 负荷组细胞核YAP染色较强（图3 A）。与对照相比，在1%负荷组中可以观察到YAP活化显著增加，如更高的YAPnuc/YAPcyt比率所示，5%负荷组也存在类似的趋势（图3 B）。蛋白质印迹检测观察到，MLC磷酸化对NMM-II的激活与YAP活化相比显示出相似的趋势，1%和5%负荷组略有增加，但信号非常弱，无显著差异（图3 C）。

这些数据表明，滑囊来源细胞中机械转导途径的部分激活，证明了它们的机械反应性，特别是在1%和5%负荷条件下。

图3 与未刺激的对照相比，滑囊来源细胞中的机械转导途径在 3 天时以 1 Hz 每天 4 小时以 1、5% 和 10% 的应变刺激。（A）所有加载和控制条件下的YAP荧光染色的示例图像。（B）YAP核易位计算为YAP阳性核面积与YAP阳性细胞质面积之间的比率，并给予未刺激对照的倍数。（C）来自蛋白质印迹分析的pMLC条带和GAPDH参考条带的代表性图像。

此外，使用研究了不同负荷条件对ECM形成和重塑重要基因表达的影响。在ECM标志物组中，COL1A1表达在5%和1 h刺激条件下趋于降低，而COL3A1表达不受机械负荷调节。Versican和Fibromodulin 的表达在机械刺激的滑囊来源细胞中保持不变。ITGA1表达不受应变依赖性调节，ITGA2表达在10%和4 h刺激条件下呈应变依赖性趋势升高。胶原酶MMP1和明胶酶MMP2的表达不受滑囊来源细胞中施加的应变条件的调节。MMP3在刺激1h时表达较低，而在加载4 h后在使用条件下均升高。在测试条件下，TIMP1表达水平在滑囊来源细胞中较高且未变化，而TIMP2表达显著降低。TIMP2 表达的降低暗示了在较高负荷条件下 MMP/TIMP 的不平衡。

最后，在蛋白质水平上研究了不同负荷条件对滑囊来源细胞的影响。与1%负荷相比，10%负荷1小时后，滑囊来源细胞的Col I分泌显著增加，与对照组相比，每天加载4小时导致所有应变量级的Col I分泌相等（图4 A）。MMP1分泌非常低，在4 h刺激组中才发现轻微的应变依赖性增加（图4 B），MMP2分泌显示出所有分析的MMPs中最高的蛋白质水平（图4 C），MMP3分泌在所有样品中均低于测定的检测限。TIMP1蛋白分泌不受机械负荷的显著调节，但与对照相比，在5%负荷的1小时刺激下观察到减少的趋势（图4 D）。

这些数据清楚地表明，滑囊来源的细胞会调整其ECM分泌和重塑过程，特别是在强烈和长时间的机械刺激下。

图4 在1 Hz下，每天机械加载1和4小时，持续 3 天后滑囊来源细胞分泌的 Col I （A）、MMP1 （B）、MMP2 （C） 和 TIMP1 （D） 的蛋白质分泌。

总之，该研究的结果表明，滑囊来源细胞具有明显的机械反应性，这可以通过它们的细胞骨架组织、YAP激活以及ECM形成和重塑的增加来证明。超过“生理应变”极限，长时间的10%应变刺激似乎会在这些细胞中诱导超负荷状态。这也表明滑囊组织及其包裹的细胞对特定的机械应变值高度敏感。在寻找与ECM形成和重塑的适应性相关的应变调节时，很明显，较高的应变幅度导致Col I分泌增加和MMP活性增加，MMP/TIMP失衡。这些发现表明，滑囊来源的细胞通过调整其基质转换和增强重塑来对高机械组织应变产生反应。这项初步研究提供了对滑囊来源细胞的机械反应性的初步见解，这种组织仅被认为是间接机械负荷的。因此，关于滑囊组织作用的观点可能需要改变，并且更详细地去了解生理学和病理学中的机械反应性是相关的，以便更全面地了解滑囊在肩关节中的作用。

参考文献：Klatte-Schulz F, Bormann N, Voss I, Melzer J, Schmock A, Bucher CH, Thiele K, Moroder P, Haffner-Luntzer M, Ignatius A, Duda GN, Wildemann B. Bursa-Derived Cells Show a Distinct Mechano-Response to Physiological and Pathological Loading in vitro. Front Cell Dev Biol. 2021 May 31;9:657166. doi: 10.3389/fcell.2021.657166. PMID: 34136480; PMCID: PMC8201779.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34136480/

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