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动脉粥样硬化主要发生在血流紊乱（d-flow）的区域，即流量低、混乱方向的非层流。当暴露于 d-flow 时，血管内皮细胞发生表型变化，导致细胞因子释放和白细胞募集增加。单核细胞是白细胞的主要类型，它们被迁移到发炎的血管壁中，成为富含脂质的泡沫细胞，这是动脉粥样硬化斑块的标志。

血管损伤后，循环中的血小板迅速粘附在受伤处内膜下组织形成止血栓以填充伤口。血小板还有助于炎症过程，这在包括动脉粥样硬化在内的许多病理条件下至关重要。血小板粘附到血流紊乱区域被证明通过促进单核细胞粘附来促进动脉粥样硬化形成。研究表明，血小板转录组特征与动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞有关。先前的研究揭示了动脉粥样硬化期间d-flow激活的内皮细胞如何导致白细胞募集。然而，血小板如何对d-flow产生反应，从而导致动脉粥样硬化的机制仍不清楚。

基于此，苏州大学唐仲英医学研究院血液学研究中心和美国俄克拉荷马医学研究基金会心血管生物学项目成员在一项研究中，以载脂蛋白E缺陷型（ApoE-/-）和 LDL 受体敲除（LDLr-/-）小鼠为研究对象，建立了小鼠部分颈动脉结扎术（PCL）诱导的颈动脉 d-flow 模型，通过免疫染色或透射电子显微镜观察d-flow诱导的血小板在内皮下或斑块中的沉积，通过特异性基因敲除小鼠进一步探讨了血小板内皮下沉积的机制。研究结果揭示了血小板在动脉粥样硬化易发区域调节血管炎症的新作用。研究成果发表在 Theranostics 期刊题为“CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice”。

血流紊乱导致的CLEC-2依赖性血小板内皮下沉积有助于小鼠动脉粥样硬化的形成

首先，为了研究血小板在d-flow诱导的动脉粥样硬化中的作用，实验使用免疫染色法检测了喂食高脂饮食（HFD）的LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主动脉弓动脉粥样硬化斑块的连续切片。共聚焦成像分析显示，4周后LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主动脉弓斑块中存在血小板。为了验证这一点，LDL-r-/- 小鼠进行PCL以产生 d-flow，然后进行HFD 喂养以产生颈动脉粥样硬化。结果显示，PCL 1周后的小鼠颈动脉斑块中CD42d+ 血小板积聚。这些结果证明，通过单细胞技术，血小板与动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞存在关联，并暗示血小板可能出现在动脉粥样硬化的相对早期发展中。

然后，使用PCL模型继续探讨了d-flow 是否诱导内皮下间隙中的血小板沉积。结果显示，d-flow 持续2天后，除了粘附在LCA的内皮上外，还在内皮下间隙诱导了大量血小板，相比之下，右颈总动脉（RCA）对照的内皮或内皮下间隙均未检测到血小板（图1 A、B）。使用共聚焦图像的三维（3D）重建进行进一步观察，证实了丰富的CD42d+ 血小板在内皮下间隙的沉积（图1 C）。为了验证循环血小板的内皮下沉积，将表达EGFP的血小板注入接受PCL 2天的小鼠中，检查EGFP标记的血小板是否积聚在颈动脉d-flow影响区域的内皮下（图1 D左）。结果显示，PCL后在LCA内皮下检测到表达EGFP的血小板，但未在RCA检测到（图1 D右）。此外，d-flow诱导内皮变形以及白细胞和血小板在扩大的内皮下间隙中沉积。值得注意的是，血小板可能与单核细胞接触（图1 E）。

图1 血流紊乱诱导小鼠血小板内皮下沉积。

众所周知，血小板在炎症期间与白细胞相互作用并促进白细胞募集。接下来，实验研究了d-flow下血小板内皮下沉积的动态变化及其与白细胞浸润的相关性。对PCL后不同时间点颈动脉的定量分析显示，血小板和F4/80+ 单核细胞/巨噬细胞的内膜和内皮下沉积在PCL后6 h出现，在2天时达到峰值，并在7 d后保持一定水平（图2 A、B、C）。进一步检查显示，沉积的血小板与单核细胞/巨噬细胞（F4/80+）或中性粒细胞（Ly6G+）接触，在PCL后形成单核细胞/巨噬细胞-血小板或中性粒细胞-血小板聚集体（图2 D），且患区与单核细胞/巨噬细胞聚集的血小板占总血小板的百分比显著高于中性粒细胞，表明血小板在内皮下沉积过程中主要与单核细胞/巨噬细胞相互作用。

此外，还检查了 d-flow 是否诱导循环单核细胞-血小板聚集体（MPA）的增加，因为循环 MPA 是动脉粥样硬化等心血管疾病发病机制的标志物。结果表明，PCL术后2天循环血液中MPA与总单核细胞的比值增加（图2 E）。这些结果支持了d-flow下血小板的内皮下沉积与单核细胞/巨噬细胞相关的观点。

然后，实验探索了哪种类型的分子介导了 d-flow 诱导的血小板-单核细胞相互作用和内皮下沉积。已发现血小板 CLEC-2 调节血管完整性，然而，CLEC-2 是否有助于 d-flow 诱导的血小板和单核细胞相互作用及其内皮下沉积尚不清楚。为了测试血小板 CLEC-2 是否调节体内 d-flow 诱导的血小板内皮下沉积，使用小鼠模型Clec2fl/fl 和 Pf4-Cre。PCL后显示血小板以MPA形式或单独形式沉积在WT小鼠变形内皮区域，而血小板敲除CLEC-2可显著抑制血小板和单核细胞在内皮细胞上的沉积。为了研究CLEC-2是否有助于d-flow诱导的血小板和单核细胞相互作用，使用小鼠单核细胞/巨噬细胞系RAW264.7，发现血小板孵育促进了RAW264.7的迁移，而与CLEC-2敲除血小板一起孵育可减少RAW264.7细胞迁移。这些结果表明，CLEC-2 在介导单核细胞-血小板相互作用及其 d-flow 下内皮下沉积中起主要作用。

图2 d-flow 诱导的血小板内皮下沉积与单核/巨噬细胞有关。

最后，为了研究血小板 CLEC-2 如何介导单核细胞-血小板聚集体的形成，研究人员检测了 d-flow 是否诱导单核细胞表达平足蛋白（PDPN），PDPN 是一种I型跨膜糖蛋白和已知的 CLEC-2 内源性配体，据报道在炎症期间在单核细胞/巨噬细胞上表达。首先在体外分析了 RAW264.7 细胞在振荡流（OS，10 ± 5 dyn/cm²）刺激 12 小时后的 PDPN 表达，结果显示，OS刺激后PDPN的表达比静态细胞上调约3倍，蛋白质水平显著增加约6倍。然后又在体内PCL后分析了PDPN在血管内膜和培养基中的表达，结果显示，d-flow刺激2天后，PDPN的表达比对照RCA上调约6倍。进一步分析显示，PDPN在d-flow刺激的F4/80+ 单核细胞/巨噬细胞中高度表达。

为了检查单核细胞/巨噬细胞PDPN是否通过d-flow介导血小板和单核细胞/巨噬细胞内皮下沉积，使用已建立的小鼠模型Pdpnfl/fl 和 LysM-cre。相比Pdpn敲除小鼠，转基因 LysM-cre小鼠显著降低单核细胞/巨噬细胞中的PDPN蛋白水平。PCL 后2天 LCA 中，Mye Pdpn-/- 小鼠血小板和单核细胞/巨噬细胞的内膜沉积减少，表明单核细胞/巨噬细胞PDPN在体内通过d-flow介导内皮下血小板和单核细胞/巨噬细胞的积聚。

然后进一步确定了敲除血小板 CLEC-2 是否会减少动脉粥样硬化，通过骨髓移植建立血小板CLEC-2缺失嵌合体Ldlr-/- 小鼠，接受PCL并用HFD喂养3周。结果显示，在Plt Clec2-/- 移植的Ldlr-/- 小鼠中斑块面积与血管腔面积的之比和巨噬细胞的沉积量分别减少了55.81%（图3 A、B）和41.59%（图3 A、C）。这些结果表明，血小板 CLEC-2 缺失可能是通过抑制血小板和单核细胞/巨噬细胞内皮下沉积来减少d-flow 形成的动脉粥样硬化斑块。

图3 血小板CLEC-2缺失可减弱d-flow诱导的动脉粥样硬化斑块形成。

图4 图形概要

研究揭示了一种响应d-flow的新的CLEC-2-依赖性血小板内皮下沉积机制以调节血管炎症。

综上所述，该研究发现血小板通过d-flow在小鼠内皮下和动脉粥样硬化斑块中沉积，这可能在动脉粥样硬化开始过程中单核细胞的募集和迁移中起关键作用。这些数据扩展了我们对动脉粥样硬化早期事件的了解，并揭示了血小板对d-flow 诱导的血管炎症和动脉粥样硬化的重要性。

参考文献：Tang C, Wang L, Sheng Y, Zheng Z, Xie Z, Wu F, You T, Ren L, Xia L, Ruan C, Zhu L. CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice. Theranostics. 2021 Oct 3;11(20):9791-9804. doi: 10.7150/thno.64601. PMID: 34815786; PMCID: PMC8581433.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815786/

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