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内皮细胞（ECs）在体内持续暴露于血流动力学剪切应力。当ECs感知剪切应力时，它们会改变细胞形态、功能和基因表达，并参与生理和病理血管生物学。对此，在血管中报道了两种类型的剪切应力：一种是层流剪切应力，另一种是扰动剪应力。层流剪切应力（LSS）具有血管保护作用，位于直动脉区域（如胸主动脉），而扰动剪切应力（DSS）对血管有害，并且位于分支或弯曲区域（例如主动脉弓）。有趣的是，研究表明，血管分支所在的血管通透性增加，动脉粥样硬化的风险也随之增加。

剪切应力的机械转导是复杂的。可以粗略地确定，剪切应力通过细胞膜分子激活各种传导途径，包括钙通道、G蛋白、酪氨酸激酶受体、粘附蛋白和细胞骨架。在剪切应力作用下，ECs最直观的表型是形态变化：ECs经历了从多边形鹅卵石状向均匀纺锤状单层的转变。这种现象被认为部分是F-肌动蛋白应力纤维诱导的结果，然而，由于剪切应力导致的这种细胞骨架组的机制尚不清楚。

Latexin （LXN）是一种长 222 个氨基酸的羧肽酶抑制剂。由于其蛋白酶抑制剂的特性，人们认为LXN可能参与蛋白质降解和代谢。LXN 也与炎症有关，因为它在巨噬细胞和肥大细胞中表达，并且可以由脂多糖诱导。然而，LXN在ECs中的作用尚不清楚。

基于此，在广西师范大学化学与药学学院、广西民族药省部共建协同创新中心及桂林医学院智能医学与生物技术学院课题团队的一项研究中，发现层流剪切应力诱导 ECs 中 LXN 的下调，从而导致细胞形态变化和 F-肌动蛋白重塑，类似于 LSS 在 ECs 中的作用那样。从逻辑上讲，研究人员假设 LXN 是一种新型调节因子，参与内皮细胞形态变化过程，并且 LXN 缺失对血管稳态具有保护作用。研究成果发表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊题为“LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells”。

LXN缺失通过促进血管内皮细胞中细丝蛋白A的蛋白水解切割来调控细胞骨架重塑

首先，HUVECs承受15 dynes/cm² 的层流剪切应力持续12小时（图1），结果观察LSS诱导细胞形状变化（图1 A），上调血管保护基因（如CPY1B1、THBD和NOS3），但下调促动脉粥样硬化基因（如VCAM1、CD36和ANGPT2）（图1 B）。有趣的是，实验发现LSS以时间依赖性方式显著抑制HUVECs中LXN的表达（图1 C-E），这促使研究人员思考LXN是否参与了ECs的功能调控。

为了探究LXN在内皮细胞中的功能作用，采用功能缺失策略。QPCR结果显示，LXN敲低降低了HUVECs中ANGPT2，但增加了THBD和NOS3的表达，表明 LXN 敲低在 ECs 中具有血管保护功能。有趣的是，在LXN敲低ECs中观察到细胞形态学变化和细胞骨架重塑，与LSS引起的ECs形态变化相似（图1 A）。转染CTL siRNA的ECs形态随机排列，呈均匀多边形，而用 LXN siRNA 转染的 ECs 从典型的鹅卵石状拉长到均匀纺锤状排列，其方向与在LSS下生长的细胞在外观上相似，并且LSS诱导的ECs形态变化可通过LXN的过表达逆转。

通过F-肌动蛋白染色进一步研究了LXN缺失对内皮细胞细胞骨架重塑的影响。结果观察到，LXN敲低导致肌动蛋白应力纤维的形成，主要在ECs中F-肌动蛋白丝的纵向分布中运行。有趣的是，实验发现ECs在对照条件下表现出大而频繁的板状伪足形成，然而，LXN敲低细胞中的板状伪足形成减少。这些数据清楚地表明，LXN至少参与了ECs中的内皮细胞形态变化和肌动蛋白细胞骨架重组。

图1 层流剪切应力下调HUVECs中LXN的表达。

接下来，为了探究LXN调控内皮形态的机制，进行了蛋白质组学筛选，以鉴定ECs中LXN的细胞内靶点，为此，裂解HUVECs，并用抗LXN抗体进行免疫沉淀。FLNA是一种支架蛋白，被确定为LXN的潜在伴侣，通过免疫沉淀和蛋白质印迹进一步验证了这种相互作用。实验验证了内源性LXN在HUVECs中与FLNA完全形成物理复合物。数据强烈表明，FLNA 可能参与与 LXN 的结合并在 ECs 中形成复合物。

细丝蛋白A（Filamin A，FLNA）是一种肌动蛋白交联蛋白，可调节与细胞形态变化和运动有关的信号转导事件。由于 LXN 调节细胞形状，因此在研究中观察到 ECs 中细胞骨架的变化和肌动蛋白重塑。LXN与FLNA的相互作用促使研究人员评估了LXN是否影响ECs中的FLNA蛋白水平。结果发现，LXN敲低不影响FLNA的mRNA水平（图2 A），但显著降低了ECs中FLNA的蛋白水平（图2 B）。有趣的是，实验发现了一个大约190 kD的新条带，它也可以被FLNA抗体识别，表明FLNA可能被降解（图2 B）。FLNA对钙蛋白酶的蛋白水解非常敏感，因此，实验推测LXN是否调节内皮细胞中的钙蛋白酶活性。

实验观察到，LXN敲低ECs中的钙蛋白酶活性增加（图2 C）。因此，用钙蛋白酶抑制剂Calpeptin处理LXN敲低ECs，通过蛋白质印迹测定FLNA及其片段，发现LXN敲低导致FLNA减少，同时FLNA裂解增加，然而，这种作用可以通过Calpeptin抑制（图2 D）。随后通过免疫染色和蛋白质印迹进一步确定了LXN敲低是否会影响ECs中全长和裂解的FLNA亚细胞定位。免疫染色显示，FLNA与LXN在细胞质中共定位，LXN敲低显著促进了ECs中FLNA从细胞质到细胞核的亚细胞易位（图2 E、F）。有趣的是，Calpeptin可以逆转LXN敲低诱导的应力纤维的形成（图2 G）。这些数据表明，LXN维持了FLNA在细胞质中的稳定性，而LXN缺失通过钙蛋白酶依赖性途径下调FLNA，促进FLNA细胞核易位。

图2 LXN 敲低调节 EC 中的 FLNA 蛋白水解裂解和亚细胞定位。

然后，实验进一步探讨了LXN敲低是否会影响细胞骨架蛋白的稳定性。结果显示，敲低LXN后整合素-β表达略有升高，而paxillin、Arp2/3和α-actinin表达显著降低（图2 H）。由于据报道，桩蛋白（paxillin）与黏着斑（FA）和细胞骨架锚定的形成有关，因此接下来研究了 FLNA 是否对 ECs 中的细胞骨架锚定有影响，如图所示4 I、F，在对照细胞中随机排列的肌动蛋白丝与其末端与黏着斑相连。

然而，在LXN敲低细胞中，肌动蛋白丝与黏着斑之间的关联被破坏，黏着斑等结构消失，从而导致F-肌动蛋白丝在细胞纵向上的分布，以及形态学变化（图2 I-i）。接下来，又敲除ECs中的FLNA（图2 J），发现斑块等局灶性粘附受损，并导致肌动蛋白应力纤维的形成，主要在EC中F-肌动蛋白丝的纵向分布中运行（图2 J-vi），这表明ECs中FLNA的减少有助于应力纤维的形成。这些数据显示了，LXN作为FLNA蛋白质复合物的功能作用，参与调节ECs中黏着斑形成和肌动蛋白丝的锚定。

最后，为了评估LXN在体内调节内皮细胞形态的作用，对WT和LXN-/- 小鼠主动脉弓内皮细胞进行染色，观察细胞形态变化和细胞骨架分布，结果表明，LXN在体内调节内皮细胞形态变化和肌动蛋白细胞骨架重组。接下来，评估了LXN缺失对体内血管功能的影响，数据表明，LXN敲除显著降低了微血管的通透性。

然后进一步评估了LXN缺失在动脉粥样硬化中的血管保护作用，实验构建了 ApoE‐/- LXN‐/‐ 型双基因敲除小鼠，用高脂饮食喂养小鼠16周，建立动脉粥样硬化模型。血管舒张能力分析表明，高脂饮食极大地损害了血管舒张功能。LXN缺失不仅能逆转高脂饮食引起的血管舒张功能障碍，还能显著改善正常小鼠的血管舒张（图3 A），进一步表明LXN缺失对血管的保护作用。最后，也是最重要的一点，发现LXN缺失显著抑制了高脂饮食诱导的动脉粥样硬化斑块的形成（图3 B、C）。这些结果表明，LXN缺失可以改善小鼠的血管功能，减轻动脉粥样硬化斑块的形成。

图3 LXN缺失可改善HF诱导的ApoE-/- 小鼠血管舒张能力和动脉粥样硬化。

LXN缺失通过促进血管内皮细胞中细丝蛋白A的蛋白水解切割来调控细胞骨架重塑

图4 静态和层流剪切应力或LXN缺失ECs中细胞形态和应力纤维网络的示意图。在正常情况下，正常 ECs中的 Arp2/3、α-actinin 和 FLNA 交联肌动蛋白丝产生横弧。在层流剪切应力下，LXN的丢失导致FLNA的蛋白水解裂解和亚细胞定位，ECs中Arp2/3、α-actinin和paxillin的下调。结果表明，ECs从典型的鹅卵石状排列拉长到均匀的纺锤状排列，并显示出F-肌动蛋白丝在细胞纵向上的分布。

综上所述，该研究结果表明，LXN缺失对血管具有保护作用。研究数据支持LXN通过与细胞骨架蛋白形成复合物，成为ECs形态的重要调节因子。LXN在血管内皮细胞中直接与FLNA相互作用，这种相互作用是功能性的，因为LXN的缺失增强了FLNA蛋白水解裂解和亚细胞定位，它可能是生理性的，因为它抑制了肌动蛋白丝与黏着斑的锚定，并导致细胞形态变化，这与层流剪切应力对 ECs 的影响相似。重要的是，实验发现LXN缺失可显著改善小鼠的血管通透性、血管舒张和动脉粥样硬化，这表明LXN缺失对血管稳态具有保护作用，为血管疾病的治疗提供了新的靶点。

参考文献：He G, Kan S, Xu S, Sun X, Li R, Shu W, Chen M. LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells. J Cell Mol Med. 2021 Jul;25(14):6815-6827. doi: 10.1111/jcmm.16685. Epub 2021 Jun 3. PMID: 34085389; PMCID: PMC8278077.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34085389/

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