机械负荷激活 MLO-Y4 骨样细胞系中的 YAP/TAZ 信号通路和趋化因子表达

机械负荷通过调节骨重塑在维持骨稳态中起重要作用。骨细胞是嵌入矿化骨基质中最丰富的细胞类型，是控制骨重塑以响应机械力的主要机械传感器。骨细胞机械传感特性导致不同类型的受体和不同的细胞内信号通路的激活。骨细胞也是核因子κB配体受体激活子（RANK-L）的主要来源，并且可以通过下调RANK-L与骨保护素的比例来负调节破骨细胞分化以响应机械负荷。

YES相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）首先在果蝇中被发现，被认为是发育过程中器官生长的主要调节因子。YAP/TAZ受到机械和细胞骨架信号的调节，并作为机械转换器控制细胞命运，以响应细胞微环境的特性。YAP/TAZ与不同的成骨细胞发生信号通路相互作用，如转化生长因子β/骨形态发生蛋白通路和Wnt/β-catenin信号通路。新出现的证据表明，YAP/TAZ在成骨细胞生成过程中的机械敏感性中起作用。以往研究还在骨细胞系MLO-Y4中证明，Piezo 介导机械转导并诱导YAP / TAZ核易位以响应剪切应力。

鉴于这些发现，已经提出了YAP/TAZ在骨细胞中的潜在作用的问题，特别是在响应3D机械负荷时。因此，在法国巴黎拉里布瓦西埃医院、巴黎大学健康学院及英国曼彻斯特曼彻斯特大学生物科学学院联合研究的一项实验中利用了一种新的承受压缩应力的3D培养模型来表征骨细胞样细胞系MLO-Y4在机械负荷下的反应。相关内容发表在 Laboratory Investigation 期刊题为“Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line”。

首先，为了确定骨细胞样细胞系响应机械负荷的最佳条件，实验对MLO-Y4细胞使用了循环机械2D拉伸和3D压缩。将循环或静态拉伸应用于2D细胞培养模型，拉伸百分比、频率、信号形式和拉伸持续时间是可调的，MLO-Y4培养物以0.3 Hz的正弦波形和3%伸长率进行接受9小时的等双轴动态拉伸。此外，在体外压缩装置将3D MLO-Y4培养物置于0-40 kPa的循环压缩下，以1 Hz的正弦波形持续9小时。与2D拉伸和卸载机械条件相比，3D培养压缩激活了某些机械敏感基因，例如E11和COX2编码Ptgs2（图1 A）。因此，后续实验选择了3D骨细胞压缩模型。

骨细胞样细胞系MLO-Y4机械负荷导致YAP/TAZ通路的激活，如靶基因Ankdr1和Tead4的表达增加所示（图1 B），免疫荧光进一步证实了YAP/TAZ信号的激活，并量化了核易位，这在机械负荷下增加（图1 C）。3D压缩不仅降低了Yap表达，而且增加了Taz表达（图1 D）。此外，3D压缩增强了YAP/TAZ的蛋白表达，从而表明YAP/TAZ蛋白的稳定（图1 E）。为了确认体内骨细胞YAP / TAZ的表达，在6月龄的小鼠股骨中进行抗体标记，在皮质骨和小梁骨中均发现YAP/TAZ染色。

图1 YAP/TAZ活化和核易位的分析。
（A）通过实时 qPCR 评估的 E11/gp38 和 Ptsg2（编码 COX-2）基因表达，以响应 2D（拉伸）或 3D 培养（压缩）中的机械负荷。（B）机械加载后通过实时qPCR评估的 YAP/TAZ 靶基因表达。（C）免疫荧光测量的 YAP/TAZ 核易位YAP/TAZ（绿色）和细胞核（DAPI，蓝色）的图像。（D）通过实时qPCR 检测机械负荷对YAP1和WWTR1 （TAZ）基因表达的影响。（E）MLO-Y4中YAP和TAZ的免疫印迹在3D培养中进行机械加载。

接下来，通过RNAseq确定由作为骨细胞机械传感过程一部分的YAP/TAZ调节的生物过程。首先筛选Yap/Taz shRNA敲低的细胞，基于Yap和Taz shRNA的沉默足以降低YAP/TAZ mRNA和蛋白质水平。

RNAseq分析证明，无论YAP/TAZ敲低如何，负荷成分占方差的大部分，这表明负荷因子的影响很大（图2 A）。图2 B-D显示了MA 图，即对数平均值（A值）与log2倍变化（M值）的对比图。在对照细胞中，Cxcl2是机械负荷诱导的上调幅度最大的基因（图2 B）。与YAP/TAZ缺失相比，3D负荷诱导了更多的富集基因（图2 B），从而避免了由这些转录共激活因子沉默引发的离散基因谱。在机械负荷下，YAP或TAZ缺失的基因反应反应有一定的相似性，表明存在一定程度的富集。Fbn2是机械负荷下骨细胞中YAP和TAZ个体缺失下上调的基因之一。此外，YAP和TAZ的沉默是有效的，因为这两种转录辅助因子都是下调最多的基因之一（图2 C、D）。

图2 主成分分析和MA（比率强度）图。
（A）机械负荷（主成分1 ，PC1）和 YAP/TAZ 沉默（主成分2 ，PC2）的主成分分析 （PCA）。（B-D）散点图描述了两个条件之间变化的分布（在y轴上：（B）shControl 卸载与 shControl 负载；（C）shControl 负载与shYAP 负载；（D）shControl 负载与 shTAZ 负载）。下调和上调基因分别以红色和绿色表示。

此外，GO分析用于鉴定骨细胞样细胞系MLO-Y4中机械负荷下由YAP/TAZ调节的生物过程。结果表明，TEAD1和TEAD2是通过YAP响应机械负荷而调节的主要基因之一，因为YAP的缺失突出了导致这些GO terms 的基因的改变。细胞加载后，与树突形态发生相关的几个GO terms 被突出显示，从而提示YAP和TAZ在骨细胞功能与腔隙-小管系统之间的关系中所起的作用。

最后，由于Cxcl2是机械负荷后MLO-Y4骨细胞中上调最多的基因，因此RNAseq分析的一部分重点关注机械负荷对趋化因子表达的影响。机械应变诱导对照细胞（shRNA对照）中Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平大幅增加。然而，YAP和TAZ的缺失消除了Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平的升高。为了确认在YAP/TAZ调节方面与趋化因子表达相关的RNAseq结果，实验使用了实时qPCR分析，观察到机械负荷确实增加了对照细胞中Csf1（M-CSF）、Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10的水平（图3）。沉默 YAP/TAZ 部分减弱了机械负荷后 Csf1 和 Cxcl3 的上调。相比之下，响应机械负荷上调的Cxcl10和Cxcl9表达不依赖于YAP/TAZ。这说明YAP/TAZ介导MLO-Y4骨细胞样细胞系机械诱导的趋化因子表达。

图3 通过RT-qPCR评估机械负荷后YAP/TAZ敲低对趋化因子表达的影响。
通过实时qPCR检测YAP/TAZ缺失的MLO-Y4细胞中CSF-1 (M-CSF)、CXCL3、CXCL9和CXCL10 mRNA的表达。

在这项研究中，利用MLO-Y4细胞开发了一种创新的3D骨细胞样细胞系培养压缩系统，以探索机械负荷诱导的基因修饰，并确定YAP/TAZ信号是否在细胞中起机械敏感介质的作用。该实验模型能够在由I型胶原组成的3D培养中研究骨细胞的机械转导，从而代表了一个更生理相关的环境，还允许应用机械压缩水平，概括作用在骨骼上的不同力，例如张力、流体剪切力和压缩力。

总之，该研究结果提供了第一个证据，证明YAP/TAZ在3D机械刺激后在骨细胞样细胞中被激活并调节趋化因子表达。研究结果表明，YAP/TAZ代表骨细胞样细胞中机械转导的调节因子，还证明了，骨细胞MLO-Y4细胞是不同趋化因子的主要来源，特别是Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10，这些趋化因子是在机械负荷下释放的。

参考文献：Zarka M, Etienne F, Bourmaud M, Szondi D, Schwartz JM, Kampmann K, Helary C, Rannou F, Haÿ E, Cohen-Solal M. Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line. Lab Invest. 2021 Dec;101(12):1597-1604. doi: 10.1038/s41374-021-00668-5. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34521992.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521992/

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