椎间盘退行性变（IVD）是导致腰痛（LBP）的主要原因，已成为影响人类生活的全球性社会问题。目前，椎间盘退变的治疗方法有保守治疗和和脊柱手术减压，旨在减轻疼痛，让患者恢复工作。然而，这两种策略都不能有效治疗 IVD 变性。目前，干细胞疗法成为修复 IVD 退行性病变的新治疗策略。间充质干细胞（MSCs）可以分化为髓核（NP）样细胞并促进细胞外基质（ECM）的合成，在治疗 IVD 变性方面表现出巨大的潜力。近年来发现，MSCs 存在于 NP 组织中，这些髓核间充质干细胞（NP-MSCs）有效地修复了 NP 组织。许多研究表明，IVD-MSCs 数量和功能的丧失与 IVD 退行性密切相关。机械应力是 IVD 退变的重要诱因。一般来说，IVD 在日常生活中经历各种机械压力。有研究报道，过度压力导致椎间盘退变与椎间盘细胞的活性和凋亡的发生密切相关，压力会通过诱导髓核细胞凋亡导致椎间盘退变。近年来，有研究显示压力不仅会导致髓核干细胞凋亡，还能影响髓核干细胞的生物学行为。因此，在椎间盘内压力等不利微环境下，如何减少髓核干细胞的死亡，将成为椎间盘退变的一种重要的治疗策略。吡格列酮被认为是过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活剂，用于治疗糖尿病，其可以调节炎症反应、细胞内脂质代谢、能量平衡等。研究报道，吡格列酮通过抗氧化应激保护胰腺细胞免受棕榈酸诱导的细胞毒性，还能通过改变 Bcl-2 表达和 caspase-3 活化来减轻由 TNF -α 诱导的细胞凋亡或细胞应激水平。此外，吡格列酮能缓解糖基化晚期终末产物诱导的软骨细胞凋亡，治疗骨关节炎。然而，吡格列酮对压缩诱导的 NP-MSCs 死亡的影响仍然未知。华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科、心内科，附属同济医院血液内科的一项研究中，采用不同的方法来评估吡格列酮对压力诱导的 NP-MSCs 凋亡的保护作用，通过检测氧化应激水平和线粒体功能以及线粒体凋亡相关蛋白，评估线粒体途径在吡格列酮保护压力诱导的 NP-MSCs 凋亡中的作用。
为了研究吡格列酮对压缩暴露的 NP-MSCs 的影响，细胞用不同浓度的吡格列酮（0 μM、10 μM、20 μM、50 μM和 100 μM）处理并暴露于 1.0 MPa 压缩力下持续36 小时，用于随后实验。对照组细胞（con）表示无药物、无压力。进行 CCK-8 测定以确定 NP-MSCs 的活性。结果表明，吡格列酮对 NP-MSCs 无细胞毒性（图1 a）。实验发现，压缩显著降低了细胞活性。为了研究吡格列酮对 NP-MSCs 的保护作用，用不同浓度的吡格列酮处理 NP-MSCs，发现吡格列酮显著减轻了压缩对细胞活力的抑制作用，并且在100 μM 的剂量下保护作用明显（图1 b）。此外，使用 EdU 掺入法检测细胞增殖。结果表明，吡格列酮组 EdU 阳性细胞数（红色荧光）多于加压组（图1 c）。这证明，吡格列酮显著减轻了压力对细胞增殖的抑制作用。
图1 吡格列酮对 NP-MSCs 活力和增殖的影响。
（a）CCK-8 测定用于评估不同浓度的吡格列酮（0、10、20、50、100 μM）对NP-MSCs 细胞活力的影响。（b）CCK-8 测定用于评估吡格列酮对压力介导的 NP-MSCs 活力的影响。Con 作为对照组。（c）荧光显微镜下 EdU 染色的代表性显微照片。红色荧光表示 EdU 阳性细胞（200x）。
吡格列酮可防止 NP-MSCs 中的压力诱导的细胞毒性
鬼笔环肽用于检测 NP-MSCs 的肌动蛋白丝。结果表明，压力明显破坏了肌动蛋白应力纤维，吡格列酮挽救了压力造成的不良后果。随后，检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放。结果表明，与对照组相比，压力显著促进了 LDH 的释放。吡格列酮显著逆转压缩力诱导的 LDH 释放。为了进一步评估吡格列酮对压缩诱导的 NP-MSCs 细胞毒性的保护作用，使用Calcein-AM / PI 染色在荧光显微镜下量化活/死细胞的数量。结果发现，吡格列酮组中的活细胞（绿色荧光）较多，而加压组中的死细胞（红色荧光）较多。这表明，吡格列酮可保护 NP-MSCs 免受压力诱导的细胞毒性。
吡格列酮对压力诱导的 NP-MSCs 凋亡的保护作用
为了探索吡格列酮对压力诱导的细胞凋亡的保护作用，使用 Annexin V-FITC/PI 双染色来检测 NP-MSCs 的细胞凋亡。结果显示，压力诱导了 NP-MSCs 凋亡。吡格列酮可显著保护压力诱导的 NP-MSCs 凋亡。为了进一步检查吡格列酮的保护作用，使用 TUNEL 染色在荧光显微镜下研究细胞凋亡的变化。TUNEL 染色显示，吡格列酮组 TUNEL 阳性细胞较压力组明显减少。这表明，吡格列酮对压力诱导的 NP-MSCs 凋亡具有保护作用。
吡格列酮降低 NP-MSCs 中的压力诱导的氧化应激
氧化应激水平的升高导致线粒体功能障碍并导致细胞凋亡。为了研究吡格列酮对 NP-MSCs 氧化应激的影响，实验使用 DCFH-DA 荧光探针检测 ROS 的产生来评估 NP-MSCs 的氧化应激水平。结果发现，与对照组相比，压力显著增加了细胞内 ROS 的产生。吡格列酮可显著降低压力诱导的 ROS 产生。此外，还通过 MDA 检测试剂盒评估了氧化应激水平。数据显示，吡格列酮显著降低了压力诱导的髓核干细胞内 MDA 的较高表达。这表明，吡格列酮减轻了 NP-MSCs 中压力诱导的氧化应激水平。
吡格列酮减轻 NP-MSCs 中压力诱导的线粒体损伤
线粒体损伤是线粒体凋亡途径中的一个重要因素。当发生线粒体膜电位（MMP）损伤时，JC-1 从 JC-1 聚合物（红色荧光）转变为 JC-1 单体（绿色荧光）。为了评估吡格列酮对 NP-MSCs 中压力诱导的线粒体损伤的保护作用，实验进行 JC-1 染色，流式细胞术分析检测 NP-MSCs 中的 MMP。结果发现，与压力组相比，压力降低了 NP-MSCs 中的红/绿比，吡格列酮显著增加了红/绿比。另外用荧光显微镜观察吡格列酮的保护作用。在加压组中，NP-MSCs 的红色荧光较少，绿色荧光较多，而吡格列酮可以增加红色荧光，减少绿色荧光。同时应用透射电镜 TEM 直观地观察 NP-MSCs 的超微结构。当 NP-MSCs 受压时，细胞核皱缩，出现凋亡小体，线粒体数量明显减少，大量的脂滴形成。幸运的是，吡格列酮可以显著减轻 NP-MSCs 超微结构的损伤。与压力组相比，吡格列酮组中细胞核相对完整，线粒体数量和形态均有所改善。
吡格列酮对加压下 NP-MSCs 线粒体凋亡相关蛋白表达的影响为了研究吡格列酮对压力诱导的线粒体凋亡途径相关蛋白表达变化的影响，实验使用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示，与吡格列酮组相比，加压组抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达降低，而促凋亡蛋白 Bax 的表达增加。此外发现，压力能促进 cytochrome c 的表达，并进一步活化 caspase-9，从而激活 caspase-3，导致细胞凋亡。然而，吡格列酮显著逆转了这些影响。此外对蛋白质水平进行了定量分析。该研究的结果表明，吡格列酮通过抑制氧化应激和线粒体损伤来减轻压力诱导的 NP-MSC 凋亡。吡格列酮对压力诱导的细胞凋亡的潜在分子保护机制涉及线粒体途径。总之，这些发现将进一步丰富椎间盘退变的治疗方法，为椎间盘退变的治疗提供理论基础。参考文献：Hu Y, Huang L, Shen M, Liu Y, Liu G, Wu Y, Ding F, Ma K, Wang W, Zhang Y, Shao Z, Cai X, Xiong L. Pioglitazone Protects Compression-Mediated Apoptosis in Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem Cells by Suppressing Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 2019 Nov 22;2019:4764071. doi: 10.1155/2019/4764071. PMID: 31885796; PMCID: PMC6893265.原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/31885796/小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。欢迎关注公众号“Naturethink”了解更多体外仿生培养知识！
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