整合素 α4β7-MAdCAM-1 相互作用的力依赖机制

淋巴细胞归巢主要是淋巴细胞表面的归巢受体与血管内皮细胞表面的黏附分子-血管地址素的相互作用为基础定向移动的一种迁移活动，是由相关黏附分子相互作用的一个多步级联反应过程，其中最主要的黏附分子是整合素α4β7。整合素α4β7是一种归巢受体分子，通过与粘膜血管地址素细胞黏附分子-1（MAdCAM-1）相互作用，可介导循环淋巴细胞在粘膜组织的血管内皮表面的滚动和稳定黏附。在此过程中，产生细胞内钙信号。钙信号调节多种淋巴细胞过程，包括淋巴细胞发育、T细胞和B细胞活化、基因转录和效应功能。虽然整合素α4β7对于循环淋巴细胞的黏附和迁移至关重要，但整合素α4β7 参与淋巴细胞的钙反应目前尚不清楚。

整合素 α4β7和 MAdCAM-1 分子间的键合和解离，发生在血液环境中，因此该过程除了受内在化学因素的影响外，还受血流剪切应力环境影响。通过G蛋白偶联受体通路激活整合素α4β7 依赖于流体剪切应力，随后的钙信号事件受流动力的影响。因此，尚不清楚外力能否调节整合素 α4β7/MAdCAM-1引发的钙反应。

细胞内钙释放和细胞外钙内流是增加淋巴细胞内Ca2+ 水平的两种主要机制。然而，细胞质Ca2+ 浓度上调的途径和整合素α4β7介导的钙反应的参与机制以及参与该信号通路的关键分子尚不清楚。迄今为止，许多作为蛋白质-蛋白质相互作用支架的衔接蛋白与整合素从外向内”信号传导有关。整合素活化蛋白Kindlin-3是Kindlin家族中白细胞中特异性表达的成员，参与“由内向外”（intside-out）和“从外向内”（outside-in）信号传导。因此，需要进一步的研究来阐明Kindlin-3在整合素α4β7 介导的钙信号中的作用。

在华南理工大学生物科学与工程学院生物力学研究所、广东省生物制药工程技术研究中心（华南理工大学）的一项研究中，使用结合荧光显微镜和平行平板流动腔的系统探讨了由整合素α4β7 介导的淋巴细胞模型RPMI 8226细胞的细胞间钙反应。在不同流动剪切应力下整合素α4β7 与MAdCAM-1结合引发的钙信号事件用延迟时间、峰值时间和峰值钙强度来描述，研究结果为分子水平上的细胞生理过程提供了新的视角。研究成果发表在 Biomolecules 期刊题为“Force-Regulated Calcium Signaling of Lymphoid Cell RPMI 8226 Mediated by Integrin α4β7/MAdCAM-1 in Flow”。

首先，为了研究流体条件下RPMI 8226细胞中整合素α4β7介导的钙信号，实验评估了RPMI 8226细胞的稳定黏附和钙反应。使用平行板流动室与荧光检测系统（图1），发现细胞在0.3 dyn/cm2的壁剪切应力下黏附在铺有MAdCAM-1的底板上。与空白对照组相比，用2% BSA（牛血清白蛋白）处理的底板上细胞的黏附数目显著减少，可见 2% BSA 基本能阻断非特异性黏附作用。此外，在底板上铺有MAdCAM-1加2% BSA 时，稳定黏附的细胞数量增加，且与浓度呈正相关。而当底板的 MAdCAM-1 分子用其抗体 F-6 阻断时，稳定黏附细胞数量显著降低。这些结果表明，RPMI 8226 细胞能黏附在铺有 MAdCAM-1 的底板上是由MAdCAM-1与其受体整合素α4β7 之间的特异性相互作用介导的。

图1 平行平板流动室与荧光检测系统相结合的示意图。深绿色细胞代表稳定粘附在MAdCAM-1底板上的RPMI 8226细胞，其钙信号被激活。浅绿色细胞仅在底板表面滑动，并包含钙信号的背景。

接下来，实验评估了黏附在铺有2和20 μg/ mL 浓度的MAdCAM-1底板上的RPMI 8226细胞的钙反应。结果表明，MAdCAM-1的浓度差异对细胞钙信号的产生有显著影响。随着MAdCAM-1密度的增加，RPMI 8226细胞中钙信号的延迟时间迅速缩短，表明整合素α4β7 和 MAdCAM-1之间的相互作用增强，加速了RPMI 8226细胞的胞质钙释放。虽然钙信号的峰值时间和峰值强度没有显著差异，但峰值时间缩短，峰值强度在一定程度上增加。这说明，阻滞整合素α4β7 和 MAdCAM-1的结合可特异性触发RPMI 8226细胞中的钙信号，且钙信号的激发速率取决于MAdCAM-1的浓度。

关于机械调控是否可以通过整合素α4β7 诱导淋巴细胞中的钙信号仍然存在不确定性。因此，评估了RPMI 8226细胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2壁剪切应力下黏附在10 g/mL MAdCAM-1底板的钙响应。结果表明，剪切应力增强了整合素α4β7和 MAdCAM-1结合诱导的RPMI 8226的钙爆释（calcium bursting）（图2 A）。增加壁剪切应力可以减少钙信号的延迟（图2 B）。同样，钙信号的峰值时间随着壁剪切应力的增大而减少（图2 C）。相反，峰值强度（钙信号的最高量）随着壁剪切应力的增加而增加（图2 D）。这些结果表明，由整合素α4β7 和MAdCAM-1的相互作用引发的RPMI 8226的钙信号受到壁面剪切应力的正向调控，外力可加快钙信号的爆释速度，增强钙信号的强度。

图2 稳定黏附的RPMI 8226细胞的力调控钙信号。
在铺有10 μg/mL MAdCAM-1浓度底板上稳定粘附的 RPMI 8226细胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2 的剪切应力下，钙信号的（A）时程、（B）延迟时间、（C）峰值时间和（D）峰值强度。

然后，为了确定钙爆释是由胞质钙释放还是细胞外钙内流引起的，用抑制剂2-APB和LaCl3分别处理RPMI 8226细胞，以0.30 dyn/cm2的壁剪切应力灌流到流动室中。结果表明，不同抑制剂处理导致钙信号激活的显著差异。2-APB处理对延迟时间、峰值时间或峰值强度无显著影响，提示2-APB阻断内质网钙通道不影响RPMI 8226细胞中的钙信号。然而，LaCl3显著增加了延迟和峰值时间，并削弱了峰值强度。也就是说，由整合素α4β7引发的RPMI 8226细胞中的钙爆释可能通过使用LaCl3抑制细胞膜上的钙通道而被削弱和减缓。这些结果表明，整合素α4β7和MAdCAM-1相互作用诱导的钙信号主要依赖于细胞膜上钙通道的激活，而不需要钙释放。

Kindlin-3是整合素信号转导中的重要衔接剂。然而，Kindlin-3协助整合素α4β7激活胞质钙爆释的机制仍不清楚。最后，为了确定Kindlin-3是否参与整合素α4β7激活的钙信号过程，在RPMI 8226中敲低了Kindlin-3的表达，并在流动条件下检查了整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用诱导的钙信号。在稳定转染的RPMI 8226 细胞系中，Kindlin-3 shRNA沉默的细胞阳性比例 >90%（图3 A、B），而且Kindlin-3的表达低于未转染的RPMI 8226细胞（图3 C）。Kindlin-3敲低细胞的典型时间过程显示钙信号显减著弱（图3 D）。与对照组相比，Kindlin-3的敲低显著延长了RPMI 8226细胞中钙信号传导的延迟和峰值时间，同时削弱了峰值强度（图3 E-G），表明Kindlin-3的阻断可能会干扰由整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用引发的钙爆释。这些结果表明，Kindlin-3参与由整合素α4β7和 MAdCAM-1之间的相互作用诱导的钙信号传导。

图3 流动条件下沉默Kindlin-3对整合素α4β7/MAdCAM-1 复合体介导的RPMI 8226细胞钙信号的影响。

图4 整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用诱导循环淋巴细胞钙信号传导的潜在机制。整合素α4β7 与MAdCAM-1 的结合在流动条件下通过需要 Kindlin-3 的共同途径诱导稳定粘附的 RPMI 8226 细胞的力依赖性钙信号，随后激活钙内流。

总而言之，该研究发现整合素α4β7 与MAdCAM-1 的结合，通过需要Kindlin-3的通路，在稳定粘附的RPMI 8226细胞中导致了力依赖性钙信号。这些发现为黏附分子介导的细胞内信号通路的机械化学调控机制提供了新的见解，为风险评估、临床诊断以及炎症性疾病和癌症治疗的有效性的新概念的发展提供了基础。

参考文献：Sun D, Luo Z, Kong Y, Huang R, Li Q. Force-Regulated Calcium Signaling of Lymphoid Cell RPMI 8226 Mediated by Integrin α4β7/MAdCAM-1 in Flow. Biomolecules. 2023 Mar 24;13(4):587. doi: 10.3390/biom13040587. PMID: 37189336; PMCID: PMC10135767.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37189336/

小编旨在分享、学习、交流生物科学等域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。
微信搜索公众号“Naturethink”，了解更多细胞体外仿生培养技术及应用。