创伤性压缩应力通过长链非编码 RNA Dancr 抑制成骨细胞分化

咬合创伤被定义为一种病理性损伤，发生在创伤力超过牙周组织的修复能力时。咬合创伤作为重要的局部影响因素，在伴有牙周炎或明显的局部刺激因素时，可能会加重牙周袋和牙槽骨的吸收。然而，这些加重影响的真正机制仍不清楚。

牙槽骨缺损主要有两个原因：破骨细胞增多导致骨吸收增加，成骨细胞功能受损导致骨形成减少。一些研究侧重于将机械刺激转化为生化信号，以探索咬合创伤对破骨细胞形成的影响和机制。然而，很少有研究关注成骨细胞功能受损和骨形成的影响。

NF-κB 作为主要的分子信号通路之一，在调节骨重塑过程中发挥着重要作用。已有的研究发现，咬合创伤通过炎症细胞因子白细胞介素-1 和白细胞介素-6 间接激活 NF-κB 信号通路，NF-κB 信号通路的激活抑制了 Wnt/β-catenin 信号通路，从而抑制了成骨细胞分化。因此，NF-κB 信号通路可以响应机械刺激调节骨形成。而应激诱导的 NF-κB 信号激活的潜在机制仍需进一步研究。

长链非编码 RNA（lncRNA）是一种长度大于 200 个核苷酸的 RNA，从基因组转录但不翻译成蛋白质。LncRNA 逐渐被发现具有广泛的生物学功能，如调节细胞生长、细胞周期、细胞分化等。DANCR（分化拮抗非蛋白质编码 RNA）是一种新发现的 lncRNA，最早由 Kretz 等人在表皮分化过程中鉴定出来。最近有报道称，DANCR 可抑制人牙周膜干细胞（PDLSCs）的成骨分化，其调节功能与 Wnt/β-catenin 通路有关。研究还发现，DANCR 与 zeste 基因增强子同源物2（EZH2）相关，从而导致 RUNX2（Runt 相关转录因子2）表达和随后的成骨分化受到抑制。

基于这些发现，四川大学华西口腔医院心血管内科、口腔疾病研究国家重点实验室的课题组曾假设 Dancr 可能参与创伤应激对成骨分化的抑制作用，研究旨在探索其在这种致病过程中的潜在功能和分子机制。

创伤性压缩应力通过长链非编码 RNA Dancr 抑制成骨细胞分化

MC3T3-E1 细胞在压力加载过程中成骨分化和 Dancr 表达受到抑制

为了确定 MC3T3-E1 细胞（胚胎成骨细胞系）中的成骨分化和 Dancr 表达是否受到影响，实验在诱导成骨 5 天后用 4000 μstrain 的循环单轴压缩应力来模拟外伤力，处理细胞 0、0.5、1、3 和 6 小时。RT-PCR 和蛋白质印迹表明，压缩应力在 0.5、1、3 和 6 小时时抑制信使 RNA（mRNA）和 Alp 的蛋白表达。Runx2 的表达水平在 0.5、1 和 3 小时受到抑制。此外，发现，Dancr 的 RNA 表达显著下降，在 3 小时达到低谷。因此，在以下实验中使用了 3 小时的压缩应力负荷。

Dancr 的沉默促进了压力诱导的成骨细胞分化抑制

定量 RT-PCR 显示，诱导成骨分化后显著增强了 Dancr、Alp 和 Runx2 在第 5 天和第 7 天的表达水平。Dancr-siRNA抑制了 Dancr 的表达水平，导致 Alp 和 Runx2 的 mRNA 和蛋白水平降低。Dancr-siRNA 也抑制了 Alp 活性。此外，在压缩应力加载后，与对照 siRNA 组相比，Dancr-siRNA 处理的细胞表达的 Alp 和 Runx2 表达水平较低。结果表明，Dancr 沉默抑制了成骨细胞分化，促进了创伤应激对成骨细胞分化的抑制作用。

Dancr 的过表达可在一定程度上缓解压力对成骨细胞分化的抑制作用

为了进一步测试 Dancr 在成骨细胞分化中的作用，通过质粒转染在 MC3T3-E1 细胞中过表达 Dancr，然后用诱导培养基培养细胞 5 天。首先，实验证实了 Dancr 被 Dancr 特异性质粒显著过表达。然后发现，Dancr 过表达对 MC3T3-E1 细胞的成骨分化影响不大。对照组和 Dancr 过表达组之间的 Alp 活性没有显著差异。

接下来研究了过表达 Dancr 对压力诱导的成骨分化抑制的影响。结果发现，与转染对照质粒的组相比，在成骨分化和压缩力加载后，Dancr 过表达增强了 Alp 和 Runx2 的表达。结果表明，Dancr 的过表达不促进成骨细胞分化，但在一定程度上减轻了压力诱导的成骨细胞分化抑制。

创伤性压缩应力通过抑制 Dancr 表达间接激活 NF-κB 信号通路

据报道，创伤性压缩应力会激活 NF-κB 信号通路，而这一发现再次得到验证。为了确定 Dancr 在调节 NF-κB 信号通路中的作用，用 Dancr-siRNA 转染细胞并用诱导培养基培养 5 天。蛋白质印迹显示，p-p65 和 p-IκBa 的表达显著增加，而 IκBa 和 p65 的表达没有显著变化。

为了进一步评估 Dancr 在压力诱导的 NF-κB 信号激活中的作用，在 3 小时的压缩力加载之前，用 Dancr 过表达质粒和诱导培养基处理细胞 5 天。结果表明，Dancr 过表达组中 p-p65 和 p-IκBa 的表达较对照质粒组明显降低，但仍高于仅用 Dancr 过表达质粒处理且无压缩应力处理的组。p65 的表达略有降低，而 IκBa 的表达没有显著变化，说明过表达 Dancr 后，创伤应激对 NF-κB 信号通路的激活作用可以得到一定程度的抑制。上述结果表明，创伤应激通过抑制 Dancr 表达间接激活了 NF-κB 信号通路。

该研究表明，创伤性压缩应力可以抑制 MC3T3-E 细胞上 Dancr 的表达，从而激活 NF-κB 信号通路，最终导致成骨分化受到抑制。

参考文献：Lu Q, Xu W, Liu L, Zhou X, Ye L, Song D, Zhang L, Huang D. Traumatic compressive stress inhibits osteoblast differentiation through long chain non-coding RNA Dancr. J Periodontol. 2020 Nov;91(11):1532-1540. doi: 10.1002/JPER.19-0648. Epub 2020 Apr 18. PMID: 32160313.

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