机械应变通过 RhoC/ROCK/MRTF-A 和 Erk1/2 信号通路在人二尖瓣膜间质细胞中诱导促纤维化表型

与其他心脏瓣膜一样，房室二尖瓣是一个复杂的多层结构，每一层都包含特定的细胞外基质（ECM）成分。二尖瓣由成纤维细胞样细胞组成，称为瓣膜间质细胞（VIC），它们与 ECM 密切接触，因此在每次心跳时都会发生影响瓣膜的机械变形，平均每年 4000 万次。

粘液瘤二尖瓣（MMV）是最常见的心脏瓣膜疾病，65岁以后，其患病率显著增加 。MMV 的特征是多个瓣膜结构的破坏、Ki-67 阳性增殖细胞的密度增加和 ECM 的改变，特别是纤维层中胶原纤维的积累和分解，弹性纤维的断裂等。

目前越来越认识到机械应力是软结缔组织重塑的主要病因之一，包括在 MMV 中观察到的病理性重塑。各种体外和离体研究调查了人类和动物 VIC 对机械负荷的表型反应。总之，它们显示出 VIC 对 SMC 表型的激活，蛋白聚糖（PGs）、糖胺聚糖（GAG）和胶原蛋白的合成增加，以及蛋白水解酶的表达和活性增加。

尽管这些研究清楚地表明机械应力在瓣膜 ECM 重塑中起基本作用，但在人类二尖瓣 VIC 中很少研究将机械信号转导成驱动组织重塑的生化信号的机制。比利时列日大学 GIGA 研究所的一项研究旨在识别受循环机械变形调控的基因以及参与其调控的下游信号通路。这些数据应该可以更好地理解 MMV 进展的机制，并可能揭示药物治疗的新靶点。

循环拉伸增加 TGFβ2、αSMA 和 CTGF/CCN2 的表达

将循环机械应变施加到 VIC 上，VIC 在补充有 0.1% FBS 的培养基中进行 14% 的循环等双轴伸长，拉伸幅度保持在生理范围内，频率为 1.16 Hz，持续 1、2、4 或 8 h。除机械拉伸（静态培养）外，对照培养平行进行。通过 qRT-PCR 研究 MMV 和力学生物学相关基因的表达。

虽然 TGFβ1 的表达在任何时间点都没有被机械拉伸改变（图1 A ），但 TGFβ2 和 αSMA 的 mRNA 水平在拉伸 1 h 后显著增加，然后恢复到静态培养值（图1 B-C）。

CTGF/CCN2 是一种基质细胞蛋白。作为一种生长因子，它促进 ECM 积累并参与许多纤维化疾病。在实验模型中，拉伸 1 h 和 2 h 后，在 mRNA 水平上已经观察到非常显著的 CTGF 表达刺激（图1 C），并持续到 4 和 8 h，并逐渐下降。蛋白质印迹显示，蛋白质产生与 mRNA 水平平行，有轻微延迟（图1 E-F）。这些数据清楚表明， CTGF 是一种特殊的机械响应标志物，有助于研究VIC对机械变形响应的分子机制。

在其他测试的基因中，TGFβ3、COL1A1、SOD1 和 MMP1，没有发现在实验条件下受到显在调节。

图1 机械拉伸诱导 TGFβ2、αSMA 和 CTGF 过表达：通过 qRT-PCR 检测机械拉伸和静态条件下，时间延长后 VIC 中 TGFβ1（A）、TGFβ2（B）、αSMA（C）和 CTGF（D）的表达。使用微管蛋白作为蛋白负荷控制，静态（—）和拉伸（+）VIC 中 CTGF 产生的代表性蛋白质印迹结果（E）。

小 RhoGTPase RhoC，但不是 RhoA，参与机械应力诱导的 CTGF 上调

RhoA 家族的小 GTPase 是关键的分子开关，参与细胞外环境和细胞骨架动力学发出的机械信号的转导。实验通过用 siRNA 沉默 RhoA、RhoC、Rac1 和 Cdc42 的表达，研究它们在机械应力诱导的 CTGF 上调中的作用。RhoA、RhoC 和 Rac1 的 SiRNA 有效且特异性地沉默了它们的靶标（图2 A）。

在静态细胞中，通过沉默 Rac1 和 RhoA 降低了 CTGF 的基础水平，而抑制 RhoC 没有影响（图2 B）。然后，在每种情况下比较了循环拉伸（黑条）与静态培养的效果。在对照细胞中，CTGF 的表达在循环拉伸时增加（图2 B ）。尽管在 siRac1 和 siRhoA 转染的 VIC 中基础 CTGF 表达降低，但其通过拉伸诱导的倍数与对照细胞相似，甚至略高，表明 Rac1 和 RhoA 不参与拉伸诱导的 CTGF 上调。相比之下，转染 siRhoC 的细胞没有反应，这表明 RhoC 在机械拉伸触发的调控中具有特定意义（图2 B）。

为了进一步支持 RhoC 在机械信号转导中的作用，进行了下拉测定，该测定允许测量 GTP 连接的活性 RhoC。如图2 C-D 所示，在拉伸 10 分钟后观察到活性 RhoC 的比例增加。Y27632 是 ROCK1/2 的特异性强效抑制剂，ROCK1/2 是 RhoA 和 RhoC 的主要效应因子，作用于参与肌动蛋白聚合的下游通路。它没有改变静态条件下 CTGF 的基础表达，但抑制了应激诱导的 CTGF 上调，无论是在 mRNA（图2 E）或蛋白质水平（图2 F-G）。由于 RhoA 在这个过程中是可有可无的（图2 B），这进一步证实了 RhoC 参与了 VIC 对机械信号的响应。

图2 RhoC 通过 ROCK1/2 调节机械应力诱导的 CTGF 表达。

MEK/Erk 通路被机械应力激活，独立于 RhoC 和 ROCK，并参与 CTGF 上调

在实验模型中评估了细胞外信号调节激酶（Erk1/2），因为它们是细胞外环境发出的许多信号的关键二级信使。在机械拉伸 5 分钟后已经观察到 Erk1/2 的快速和瞬时磷酸化（图3 A），并在 15 分钟后恢复到基础值。U0126 对 Erk1/2 的上游激活剂 MEK 的抑制有效地抑制了 VIC 中 Erk1/2 的磷酸化。虽然这种抑制剂在静态条件下没有改变 CTGF 的基础水平，但它在循环拉伸时完全消除了其 mRNA 和蛋白质过表达（图3 B-D）。

为了评估 MEK/Erk 通路的激活是否取决于 RhoC/ROCK 通路，在用 siRhoC 转染并进行机械拉伸 10 分钟的 VIC 中测量 Erk1/2 的磷酸化。如图3 E 和 3F 所示，在拉伸条件下，在 siRhoC 和 siScramble 转染细胞中，Erk1/2 磷酸化水平相似。因此，用 ROCK 抑制剂 Y27632 处理拉伸的 VIC 不会影响 Erk 1/2 的活化（图3 G-H）。这些结果表明，通过机械应力激活 Erk1/2 通路与 RhoC/ROCK 轴无关。

图3 MEK/Erk1/2 信号由机械应力激活，独立于RhoC 和 ROCK，并参与应力诱导的 CTGF 表达。

循环拉伸诱导 MRTF-A 的核转位

由于 RhoGTPases/ROCK1/2 是基于肌动蛋白的细胞骨架动力学的关键调控因子，假设机械拉伸可能通过招募球状肌动蛋白分子刺激纤维肌动蛋白的形成，这将导致 MRTF-A（心肌素相关的转录因子A）从其与球状肌动蛋白的复合物中释放。一旦游离在细胞质中，MRTF-A 就被转运到细胞核中，在那里它与 SRF 结合以激活靶基因的转录，特别是 CTGF。通过对静态和拉伸状态下细胞中的 MRTF-A进行免疫染色（图4 A）和相对于细胞的总荧光定量核标记（图4 B）来评估该过程。

在静态培养中，>40% 的细胞的细胞核中 MRTF-A 含量非常低，只有 3% 的细胞具有更强的核标记。机械拉伸后，百分比完全相反，证明了 MRTF-A 的核易位。

MRTF-A 核易位抑制剂 CCG1423 抑制了拉伸细胞中 CTGF 的上调（图5 A-C ），而不影响其在静态培养物中的基础表达。用显示阻断 CTGF 表达的 3 种抑制剂（Y-27632、CCG1423、U0126）处理拉伸培养物有效地消除了增加的 MRTF-A 核转位（图5 D-E）。

图4 循环拉伸诱导 MRTF-A 核易位。具有低 MRTF-A 荧光的细胞核用箭头表示，而那些具有强 MRTF-A 荧光的细胞核用星号表示（A）。在 4 个独立实验中，相对于对 58 个（静态）和 45 个（拉伸）细胞测量的细胞总荧光（%），MRTF-A 的核荧光（nf）染色的细胞分布（%）（B）。

图5 抑制 MRTF-A 易位消除了拉伸诱导的 CTGF 过表达。

CTGF 诱导细胞外基质基因的表达

为了评估 VICs 是否可以对 CTGF 有反应，用重组人 CTGF 处理单层培养物。处理 48 h 后，已知 CTGF 靶基因 COL1A1 和纤维调节蛋白的表达显著上调（图6 A-B）。有趣的是，CTGF 还诱导了其自身表达和 CCN 家族的另一成员 Cyr61/CCN1 的表达（图6 C-D）。

实验最后测试了可能受 CTGF 调控的其他基因，例如 PAI-1、TIMP1 和蛋白聚糖，例如 versican、 biglycan、lumican 和 decorin。在实验环境中，它们都没有受到调节，显示 VIC 对 CTGF 的反应具有特异性。

图6 CTGF 促进ECM基因及其自身的表达。在用人重组 CTGF（30 ng/ml）处理 48 小时的 VIC 中测量 COL1A1（A）、纤维调节蛋白（B）、CTGF（C）和 Cyr61（D）mRNA 的表达。

图7 图形概要

总之，该研究结果首次显示 RhoC/ROCK/MRTF-A 轴的核心作用，它与 MEK/Erk1/2 一起通过机械应变调节二尖瓣膜间质细胞中促纤维化表型的诱导。一系列的 MRTF-A 抑制剂已开发和证明是治疗硬皮病等纤维化疾病的潜在新疗法。根据该实验的原始数据，MMV 的药理学治疗是否可以成为这些抑制剂的另一种治疗应用是值得研究的。

参考文献：Blomme B, Deroanne C, Hulin A, Lambert C, Defraigne JO, Nusgens B, Radermecker M, Colige A. Mechanical strain induces a pro-fibrotic phenotype in human mitral valvular interstitial cells through RhoC/ROCK/MRTF-A and Erk1/2 signaling pathways. J Mol Cell Cardiol. 2019 Oct;135:149-159. doi: 10.1016/j.yjmcc.2019.08.008. Epub 2019 Aug 20. PMID: 31442470.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31442470/

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