椎间盘退变器官培养模型中线粒体ROS诱导的程序性NP细胞死亡

退行性椎间盘疾病（DDD）是一种慢性脊柱疾病，其特征是椎间盘（IVD）结构退变、蛋白水解活性增加、髓核（NP）细胞死亡和促炎细胞因子释放。非生理性机械应力（MS）被认为是发生腰椎DDD的重要危险因素。过度的MS会导致细胞死亡和细胞外基质（ECM）降解，从而导致IVD的显著结构变化。坏死性凋亡和细胞凋亡是与腰椎DDD有关的两种主要程序性细胞死亡类型。尽管研究证据越来越多，但MS诱导的DDD的机制尚未完全阐明。

MS诱导的线粒体活性氧（ROS）生成具有多种复杂机制，包括细胞内Ca²+超载和细胞骨架应变。一些研究强调了线粒体ROS在NP细胞机械损伤中的重要性。过量的ROS生成通过对蛋白质、核酸、脂质和细胞器造成损害来激活多种细胞凋亡途径。近年来，越来越多的研究强调了线粒体ROS在NP细胞程序性死亡中的关键作用，为腰椎DDD的进展提供了重要的新见解。

一些研究表明，高强度负荷是导致DDD的一个重要因素。基于这一发现，中山大学附属第七医院骨科、附属第一医院脊柱外科，深圳大学第一附属医院运动医学科学科以及北京市创伤骨科研究所的一项联合研究曾成功建立了椎间盘退变器官培养模型，目的是研究MS后程序性细胞死亡，ECM变性和线粒体ROS产生的发生。更重要的是，通过测量细胞反应来评估MS、线粒体ROS、程序性细胞死亡和ECM变性的相关性，以帮助阐明DDD的分子病理生理学。相关内容发表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊题为“Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model”。

首先，实验先检测MS（40%应变，1-7天）后不同时间点NP细胞中的ROS产生。数据显示，MS显著增加了ROS阳性细胞比例，并在前12小时内保持在稳定的高水平，之后，ROS阳性细胞的比例急剧下降，并在48小时达到低水平，而生理负荷培养组ROS阳性细胞比例保持稳定。线粒体电子传递抑制剂鱼藤酮显著降低了MS后ROS阳性细胞的比例（~78%），线粒体ROS清除剂MitoQ也显著降低了ROS阳性细胞的比例（~73%）。

然后，采用JC-1染色用于监测MS后NP组织中的线粒体膜电位，观察到MS组NP细胞线粒体膜电位显著降低，MitoQ预处理可部分减弱此效应。这些结果表明，MS能够直接诱导线粒体功能障碍。此外，计算GSSG/总谷胱甘肽比值以进一步评估NP组织中的ROS水平，观察到MS处理提高了GSSG/总谷胱甘肽比值，MitoQ预处理减弱了此效应，而且MitoQ显著抑制了MS引起的过氧化氢酶（CAT）的mRNA表达。这些结果表明，时间依赖性ROS积累主要来源于MS后的线粒体。

接下来，为了探索MS后NP细胞死亡机制，实验培养了IVD，并随后分析了不同时间点的细胞活力。MS在IVD中的应用导致NP细胞活力的显著时间依赖性降低（图1 a、b），一小部分NP细胞在MS后立即死亡，超过70%的NP细胞死亡发生在MS后12至48小时内。因此，MS后细胞死亡的程度和机制随时间而变化。MS处理12小时后NP细胞活力的急剧下降表明，除了由MS直接引起的坏死外，程序性细胞死亡也被激活。因此，IVDs用Z-VAD-FMK、Nec-1或MitoQ预处理2小时，然后进行MS，细胞活力分析表明，与MS组相比，抑制剂预处理显著减轻了NP细胞的死亡（图1 c）。

图1 MS诱导的NP细胞死亡的时间过程。

进一步地，实验研究了细胞凋亡指示基因（CASPASE3、BCL2和BAX）和坏死性凋亡指示基因（RIP1、RIP3和MLKL）的相对变化。MS后12小时，细胞凋亡和坏死性凋亡基因的mRNA表达水平显著升高，MitoQ预处理缓解了部分变化（CASPASE3、RIP1、RIP3和MLKL）。免疫荧光染色结果显示，在MS后12小时，细胞凋亡和坏死性凋亡（MLKL）基因水平显著增加，MitoQ预处理显著抑制程序性细胞死亡相关标志物MLKL、CASPASE3和BAX的表达，提高BCL2的表达。此外，TUNEL染色表明MitoQ显著逆转了MS引起的NP细胞凋亡。

为了确定MS是否对NP细胞程序性死亡有长期影响，在7天持续的MS组中测量了细胞凋亡和坏死性凋亡基因和蛋白质的mRNA/蛋白质水平。结果表明，这些标志物的水平在7天MS组和7天CON组之间没有显著差异，凋亡水平同样无显著差异。

此外，还对NP组织进行了代谢分析。与CON组（0.02-0.2 MPa；0.2 Hz；1 hour/day）相比，MS组在MS后12小时表现出上调的分解代谢基因（MMP1、MMP3和ADAMTS5）表达水平和下调的胶原II型α1（COL2A1）表达水平，MitoQ预处理可部分缓解MS诱导的代谢失调。为了进一步研究代谢失调的程度，使用DMMB方法分析了累积糖胺多糖（GAG）释放，MS在第7天显著增加了累积GAG的释放量，MitoQ 预处理部分防止了 GAG 的丢失。

最后，观察了IVDs的动态压缩刚度和形态。在MS后的第一天，CON、MS和MitoQ + MS组的动态压缩刚度变化没有显著差异（图2 c）。与CON组相比，MS组IVDs在第7天表现出显著较低的刚度，但这种差异被MitoQ减弱（图2 d）。这些结果表明，MS部分通过线粒体ROS降低了IVD的硬度。然后，通过Safranin O/Fast Green和苏木精染色评估IVDs的形态。MS应用7天后，MS组的退行性变评分明显高于CON组。此外，MS应用后第4天和第7天之间的退化评分没有显著差异。在MitoQ预处理的IVDs中，退行性变评分显著降低（图2 e、f）。

图2 线粒体ROS参与MS诱导的IVD动态压缩刚度降低和形态退行性改变。

总之，该研究的数据表明，在MS后的早期时间点，ROS诱导程序性NP细胞死亡和ECM降解，这些累积的ROS主要来自线粒体。这些发现表明，在MS后立即使用线粒体靶向的抗氧化剂可能是预防DDD发病或进展的有希望的方法。研究结果也为DDD的病理机制提供了新的见解。

参考文献：Li BL, Liu X, Gao M, Zhang F, Chen X, He Z, Wang J, Tian W, Chen D, Zhou Z, Liu S. Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model. Oxid Med Cell Longev. 2021 Aug 31;2021:5608133. doi: 10.1155/2021/5608133. PMID: 34512867; PMCID: PMC8426058.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34512867/

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