恩格列净可减轻内皮炎症并减弱由持续糖萼破坏引起的内质网应激信号传导

内皮糖萼（GCX）是一种富含糖胺聚糖和蛋白聚糖的功能层，分布在内皮细胞内，通过其作为机械传感器和炎症细胞附着的屏障作用促进体内平衡。GCX在病理状况（如2型糖尿病（T2D）和动脉粥样硬化）中的破坏导致内皮细胞（EC）功能障碍，从而导致心血管疾病进展。特别是，EC GCX的主要成分硫酸乙酰肝素（HS）的体外和体内降解已被证明会损害剪切力调节的一氧化氮（NO）的产生并促进炎症细胞的粘附。鉴于其在EC稳态中的核心作用，GCX被认为是预防或缓解EC功能障碍的潜在治疗靶点，因此有益于临床结果。

恩格列净（EMPA）属于钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂（SGLT2i）类药物，用于治疗T2D和心力衰竭。动物研究表明，EMPA对非糖尿病条件下的动脉粥样硬化、心力衰竭和缺血再灌注损伤具有多效性和扩展保护作用。尽管已经提出了心脏和血管保护机制，EMPA促进EC稳态并进而有助于改善血管健康的确切机制仍有待澄清。

在加拿大麦吉尔大学化学工程系以及健康中心课题组的一项研究中，考虑到GCX健康在EC功能中的重要性以及EMPA改善心血管预后的显著能力，假设EMPA可以克服由GCX破坏引起的EC功能障碍，这可以部分解释血管健康的改善。之前已经证明，EMPA可以通过急性降解后恢复的GCX的剪切力机械转导使ECs的炎症反应正常化。由于GCX是一个具有再生潜力的动态表层，因此该研究旨在更深入地探索持续GCX破坏下涉及的信号通路，以确定EMPA的其他抗炎机制。

EMPA 诱导的抗炎反应独立于 HS

持续的HS降解用于评估ECs对独立于HS的EMPA的炎症反应。对TNF-α处理的细胞进行炎症细胞粘附测定，与对照组相比，EMPA显著降低了NB4细胞粘附（图1）。虽然持续降解导致NB4细胞粘附显著增加，显示出增强的炎症反应，但EMPA将粘附降低到与未降解组相同的水平，并低于对照组。这表明EMPA可防止ECs对TNF-α刺激和HS降解的炎症反应。由于它在持续降解下持续存在，因此可以假设EMPA可以独立于HS减少炎症。

图1 剪切培养24小时后的NB4急性早幼粒白血病细胞粘附测定

（a）在有或没有EMPA处理的持续HS降解下，NB4细胞粘附到TNF-α刺激的ECs的相对数量。与对照组相比，降解导致粘附增加。与对照组相比，EMPA降低了粘附力，并防止了降解引起的增加，导致粘附水平低于对照组。

（b）每种条件的代表性图像。

ICAM-1 和 eNOS 与 HS 非依赖性 EMPA 抗炎反应无关

通过评估eNOS和ICAM-1的表达，以表征持续HS降解诱导的炎症反应及其在EMPA提供的恢复效果中的潜在作用。培养24小时后，与TNF-α对照相比，所有静态和剪切TNF-α+ 条件下的eNOS表达均降低（图2 a）。未观察到EMPA和降解对eNOS表达的影响。与无TNF-α的静态对照相比，剪切力（10 dyne/cm2）显著提高了磷酸化-eNOS 在Ser1177位点的水平（图2 b）。在所有剪切条件下，TNF-α刺激使剪切力诱导的磷酸化eNOS Ser1177的增加降低到相似水平，表明eNOS活化降低。同样，没有发现由EMPA或降解引起的磷酸化eNOS Ser1177的显著影响。同样，TNF-α在所有条件下诱导ICAM-1的表达到相似水平（图2 c），剪切力、EMPA或降解均无显著影响。有趣的是，在剪切条件下，有或没有TNF-α的情况下，磷酸化-eNOS Ser1177/总eNOS比率保持不变，而在静态培养中发现的比率显著更高（图2 d）。这些结果表明，eNOS的激活和ICAM-1的表达与EMPA对EC功能障碍的HS独立恢复没有直接关系。

图2培养24小时后通过蛋白质印迹密度测定进行蛋白表达定量。

评估（a）eNOS、（b）磷酸化eNOS Ser1177、（c）ICAM-1和（d）磷酸化eNOS/总eNOS的比率的表达。（e）代表性条带和培养条件细节。

由持续HS降解引起的未折叠蛋白反应的诱导部分通过EMPA恢复

为了探索HS和EMPA持续降解影响的可能信号通路，超越GCX的传统机械生物学和抗炎作用，进行了全基因组转录组分析，试图更好地了解EMPA防止剪切力培养下HS持续降解引发的炎症反应增加的机制。筛选EC功能障碍相关基因并分组，根据其折叠变化确定所涉及的信号通路。

剪切力下（10 dyne/cm2）暴露24 h显示，与静态对照相比，eNOS（NOS3）、KLF2和COX-2（PTGS2）等标志性基因受到调控，炎症信号基因（IL1B、IL6）下调。剪切力也略微下调了ICAM-1的mRNA表达。

HS在剪切作用下持续降解，导致与未折叠蛋白反应（UPR）和C / EBP同源蛋白（CHOP）转录因子相关的基因上调，表明ECs受到内质网（ER）应激的影响。因此，与对照组相比，激活转录因子3（ATF3），DNA损伤诱导转录本3（DDIT3）和Tribble同源蛋白3 （TRIB3）在HS降解下显著上调（图3 a）。通过活化转录因子4（ATF4）、真核翻译起始因子2α激酶3（EIF2AK3；PERK），ER伴侣蛋白Grp78（HSPA5）、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD34（PPP1R15A）的上调，UPR的激活也很明显（图3 b）。在HS降解下，EMPA显著降低了ATF3、DDIT3、HSPA5、PPP1R15A、TRIB3的表达。持续HS降解和EMPA诱导的转录调控似乎主要通过UPR的PKR样ER激酶（PERK，EIF2AK3）/真核起始因子2（eIF2）/ATF4分支介导（图3 c）。这些结果表明，剪切力下的HS降解通过激活UPR促进EC功能障碍，进而激活CHOP介导的细胞凋亡。EMPA处理可通过下调关键UPR基因的转录水平来减轻ER应激。

图3 持续HS降解和EMPA处理对ER应激基因转录的影响

EMPA通过调节TXNIP潜在地减轻炎症

EMPA被发现可降低影响氧化应激调节的硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表达，并与ER应激有关。实验发现在静态培养物中用EMPA处理6小时可下调TXNIP的mRNA表达。暴露于剪切力24小时后，TXNIP mRNA水平显著降低。持续的HS降解部分消除了剪切了诱导的调控，用EMPA处理通过显著降低降解引起的升高水平使其表达正常化。持续的HS降解也导致TXNIP蛋白表达显著增加，与mRNA水平相似，与对照组相比，EMPA使表达正常化。这表明TXNIP可能是ER应激反应的潜在介质，因为它的mRNA和蛋白质表达受到剪切，持续HS降解和EMPA的调节。

N-Acetyl-L-cysteine处理可降低NB4细胞粘附

为了进一步研究由EMPA引起的NB4细胞粘附减少，实验试图确定这种效应是否是通过调节剪切力下的氧化应激和HS持续降解介导的。在粘附测定之前，ECs在剪切力下暴露24小时，用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理。与对照组相比，NAC没有显著减少粘附的NB4细胞的数量（图4）。然而，在持续降解的情况下，用NAC处理导致粘附显著降低，与EMPA提供的效果相当。这可能表明，剪切力暴露期间氧化应激的缓解是EMPA处理的ECs减少其对HS持续降解的炎症反应的潜在机制。

图4 用NACNB4进行细胞粘附测定以减轻氧化应激

（a）在剪切培养下处理和持续HS降解后，NB4细胞粘附于TNF-α刺激EC的相对数量。（b） 每种条件的代表性图像。

总之，该研究提出了一种可能的机制，通过这种机制，EMPA可能有助于改善内皮健康。研究结果表明，EMPA具有独立于HS介导的功能而减弱EC炎症的潜力，如HS持续降解下炎症细胞粘附的减少所示。EMPA下调促凋亡信号和TXNIP表达可能有助于减轻氧化应激，从而限制ER应激下的氧化损伤，并导致炎症细胞粘附减少。未来的研究应旨在研究TXNIP通过NLRP3炎症小体和凋亡信号表达炎症反应的调控机制。更好地了解SGLT2i对GCX介导的EC功能的影响可能有益于在发现慢性GCX损伤的病理条件下限制EC功能障碍的新策略。

参考文献：Campeau MA, Leask RL. Empagliflozin mitigates endothelial inflammation and attenuates endoplasmic reticulum stress signaling caused by sustained glycocalyx disruption. Sci Rep. 2022 Jul 25;12(1):12681. doi: 10.1038/s41598-022-16763-6. PMID: 35879337; PMCID: PMC9314417.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35879337/

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