BDNF/TRKB轴通过与人腮腺癌中癌症相关成纤维细胞的串扰刺激EMT进展以诱导细胞侵袭性

腮腺癌（PGC）是头颈部肿瘤中罕见的恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的0.5%。PGC由多种组织学亚型组成，几种关键蛋白的表达水平是预测PGC预后和治疗策略的重要特征。然而，PGC的分子特征知之甚少。

原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族由三种酪氨酸激酶受体组成：TRKA、TRKB和TRKC，分别由NTRK1，NTRK2和NTRK3基因编码。在各种人类恶性肿瘤中观察到异常的TRK信号传导，TRK家族正在成为抗癌治疗的关键靶标。原肌球蛋白受体激酶B（TrkB），也称为酪氨酸受体激酶B ，是TRK家族中记录最充分的成员之一。TRKB及其配体脑源性神经营养因子（BDNF）在包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌等在内的各种癌症类型中高度表达，并与生存率低有关。

癌细胞中BDNF/TRKB通路的上调通过RAS/MAPK、PI3K/PDK1/AKT和PLCγ通路促进细胞增殖和存活，并通过诱导Zeb1、Twist和/或Snail诱导失巢凋亡抑制和上皮-间充质转化（EMT）。在基质细胞中，癌症相关成纤维细胞（CAFs） 对 EMT 至关重要，并通过分泌生长因子和炎症介质（如 TGF-β、HGF、FGF 和 IL-6）直接或间接支持肿瘤生长、侵袭和转移。CAFs还分泌BDNF来调节某些类型癌症的癌症进展。然而，BDNF / TRKB通路在PGC细胞中的作用及其与CAFs的相互作用仍然知之甚少。

在日本大阪药科大学医学部的一项研究中，调查了BDNF / TRKB通路在PGC中的参与。通过初级共培养系统以及对PGC患者人类样本的免疫组织化学和临床病理学分析，证明了PGC细胞中BDNF / TRKB通路的上调通过与CAFs的串扰调节PGC细胞侵袭性。研究结果强调了BDNF / TRKB通路作为具有侵袭性和转移性特征的PGC的治疗靶点。

BDNF和TRKB在PGC组织癌细胞和间充质细胞中的高表达

为了研究BDNF / TRKB通路在PGC细胞与周围生态位之间相互作用中的参与，首先使用免疫组织化学分析检查了BDNF和TRKB在PGCs患者肿瘤组织中的分布和表达水平。如图1所示，发现BDNF和TRKB在癌细胞以及成纤维细胞和血管内皮细胞等基质细胞中的高表达。在填充肿瘤微环境的利基细胞中，CAFs最丰富，并且与癌症进展密切相关。值得注意的是，在几种类型的癌症中，BDNF / TRKB通路参与了癌细胞和CAFs之间的通讯。

图1 BDNF和TRKB在PGC组织中的癌细胞和间充质细胞中的高表达

PGC患者肿瘤组织中BDNF和TRKB的H&E和免疫染色的代表性图像。T：肿瘤区，M：间充质区，V：血管。

在PGC细胞中通过与CAFs共培养促进EMT和BDNF上调，通过TRKB抑制剂抑制CAF介导的Snail 上调

为了阐明BDNF / TRKB通路在PGC进展中的作用的分子机制，从PGC患者切除的人肿瘤组织中建立了一个PGC细胞和两个CAF系（图2 a）。首先使用蛋白质印迹和免疫荧光分析确认细胞是PGC细胞和CAFs（图2 b）。分离的PGC细胞对E-钙粘蛋白（上皮标志物）大多呈阳性，对Vimentin，α-SMA和N-钙粘蛋白（间充质标志物）呈阴性，而分离的CAFs对Vimentin，α-SMA和N-钙粘蛋白呈阳性，对E-钙粘蛋白，VE-钙粘蛋白和PECAM-1（内皮标志物）呈阴性。此外，TRKB被高度表达（图2 b），TRKB磷酸化在培养的PGC细胞中被BDNF刺激后上调。TRKB在培养的CAFs中适度表达（图2 b）。BDNF在PGC细胞和CAFs中均有表达（图2 b）。

由于直接与CAFs共培养的PGC细胞表现出EMT相关特征，细胞间粘附减弱，细胞形状拉长（图2 c），实验进行了免疫荧光分析，以确认分子表达的变化是否由EMT引起。锌指蛋白SNAI1（Snail）是EMT的主要调节转录因子，在直接与CAFs共培养的PGC细胞中被诱导（图2 d），表明共培养的PGC细胞促进了EMT。此外，共培养的PGC细胞中的BDNF表达高于单独培养的PGC细胞（图2 e）。Snail 和BDNF表达水平在用条件培养基（CM）处理的PGC细胞中也上调，这些CM 来自PGC细胞与CAFs的共培养物，但用来自PGC细胞或CAFs培养物的CM处理其表达不会改变（图2 f）。此外，在PGC细胞中，诱导Snail 表达后E-钙粘蛋白表达水平降低。来自PGC细胞与CAFs共培养的CM包括BDNF。蛋白质分析还表明，CM处理提高了PGC细胞中TRK及其下游Akt和Erk1/2的磷酸化水平（图2 g）。

免疫荧光和蛋白质印迹分析显示，直接与CAFs共培养或用共培养的CM处理的PGC细胞中 Snail 的诱导和E-钙粘蛋白的降低被TRKB抑制剂ANA-12部分抑制（约54%和22%）。这些数据表明，PGC细胞和CAFs之间的串扰至少部分地通过与CAFs共培养产生的可溶因子激活PGC细胞中的BDNF / TRKB通路来促进EMT。

图2 通过与CAFs共培养，促进PGC细胞中EMT和BDNF的上调

TRK抑制剂抑制BDNF诱导的PGC细胞迁移

BDNF/TRKB通路介导肿瘤细胞迁移和侵袭。BDNF是从PGCs和间充质细胞（如CAFs）分泌的（图1），用TRKB抑制剂通过与CAFs的相互作用部分阻断PGC细胞中 Snail 的上调，表明BDNF/TRKB通路可能促进PGC细胞运动。为了验证这一点，使用伤口愈合测定法检查BDNF诱导的PGC细胞迁移（图3 a）。PGC细胞迁移倾向于被BDNF刺激上调，并且这种上调通过LOXO-101（泛TRK抑制剂）或ANA-12（TRKB特异性抑制剂）处理完全抑制。这些结果与BDNF处理增加TRKB磷酸化的发现一致，并且这种增加被LOXO-101处理以剂量依赖性方式减弱（图3 b）。此外，来自PGC细胞与CAFs共培养的CM也诱导了PGC细胞的细胞迁移，并且用LOXO-101或ANA-12处理显著抑制了迁移（图3 c）。

图3 TRK抑制剂抑制BDNF诱导的PGC细胞迁移

PGC细胞中TRKB表达水平高，与PGC患者预后不良相关

原代细胞培养系统表明，PGC细胞中的TRKB表达有助于促进PGC细胞的恶性行为，这表明TRKB表达可能是PGC患者的关键预后标志物。接下来明确了TRKB表达在PGC患者中的临床意义，实验发现未接受术前化疗的PGC患者切除标本中TRKB的表达水平高，在肿瘤组织附近的正常组织中，检测不到TRKB。然后评估了TRKB表达水平，大多数PGCs表现出超过50%的TRKB阳性肿瘤细胞和不同的TRKB表达水平。

同时分析了TRKB表达水平与PGC临床意义的相关性。TRKB表达与性别、T分类、临床分期、神经浸润、面神经麻痹无显著相关性。相比之下，TRKB表达与淋巴结转移、复发和血管浸润显著相关。

为了阐明TRKB表达水平与PGC预后之间的关系，使用Kaplan-Meier方法分析了5年生存率。如图4所示，高TRKB 表达患者的无病生存率显著低于那些低 TRKB 表达的患者。这些发现表明，高TRKB是PGC患者复发和预后不良的危险因素。

总的来说，这些数据表明 PGC 中的 TRKB 表达水平显著升高，并且高 TRKB 表达与血管浸润、淋巴结转移和预后不良有关。

图4 高TRKB表达的PGC患者预后不良。使用Kaplan-Meier方法分析TRKB的表达水平与5年无病生存期之间的关系

总之，该研究证明了BDNF / TRKB通路通过与CAFs的串扰在PGC细胞中上调，并且BDNF诱导的PGC细胞迁移被TRK抑制剂抑制。此外，观察到临床PGC中的高TRKB表达与不良预后相关，包括PGC患者的血管浸润，淋巴结转移，复发和生存率。这些结果表明，BDNF/TRKB通路可能通过与CAFs的串扰促进PGC细胞侵袭性。研究结果强调BDNF / TRKB轴是具有侵袭性和转移性特征的PGC的潜在治疗靶点。

参考文献：Moriwaki K, Wada M, Kuwabara H, Ayani Y, Terada T, Higashino M, Kawata R, Asahi M. BDNF/TRKB axis provokes EMT progression to induce cell aggressiveness via crosstalk with cancer-associated fibroblasts in human parotid gland cancer. Sci Rep. 2022 Oct 20;12(1):17553. doi: 10.1038/s41598-022-22377-9. PMID: 36266462; PMCID: PMC9584965.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36266462/

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