肾小管上皮细胞来源细胞外囊泡通过稳定糖尿病肾病中的HIF-1α诱导巨噬细胞糖酵解

蛋白尿是糖尿病肾病（DKD）发展的独立危险因素，可直接导致肾损伤。多项研究表明减少蛋白尿可延缓终末期肾病的发展，然而，这些方法仍然不能令人满意。

重吸收尿白蛋白的肾小管上皮细胞可以释放趋化因子诱导免疫细胞，导致肾损伤。巨噬细胞是肾组织中最重要的免疫细胞类型，可诱导肾纤维化。研究发现，肾巨噬细胞表达纤维化基因，可导致肾纤维化。由于巨噬细胞在疾病进展过程中起着复杂的作用，因此需要进一步探索其在DKD中的作用机制。

研究表明，损伤刺激下巨噬细胞的代谢变化与肿瘤细胞中的相似。刺激后，巨噬细胞引起糖酵解途径的大量激活，其特征在于葡萄糖消耗增加，乳酸合成和糖酵解。最近的研究表明，巨噬细胞的两种表型都表现出糖酵解活化增加。

肾小管上皮细胞和巨噬细胞之间的串扰是调节巨噬细胞功能的关键。新出现的证据表明，细胞外囊泡（EV）介导信息从肾小管上皮细胞到巨噬细胞的转移。之前发现白蛋白可以通过EVs促进巨噬细胞M1极化。因此，肾小管上皮细胞衍生的EVs也可能影响巨噬细胞代谢状态。

目前，DKD期间肾巨噬细胞的代谢状态尚不清楚。研究发现高血糖可以上调骨髓来源的巨噬细胞糖酵解。然而，被肾小管上皮细胞重吸收的白蛋白是否可以通过EVs影响巨噬细胞的代谢状态尚不清楚。南方医院内分泌代谢科、深圳市人民医院内分泌科、中山大学附属第五医院内分泌科的联合课题组研究了人血清白蛋白（HSA）对DKD期间肾巨噬细胞代谢状态的影响及其潜在机制。

糖尿病肾巨噬细胞中糖酵解增加

为了探索DKD期间肾巨噬细胞的代谢状态，使用2型糖尿病模型db/db小鼠，与非糖尿病db/m小鼠相比，通过qRT-PCR（图1 A）和免疫组化染色（图1 B）显示，db/db小鼠纤维化（FN，α-SMA和Col-I）和炎症（IL-6）标志物的表达增强。

为了探索DKD期间肾巨噬细胞的代谢状态和功能，分离了小鼠肾巨噬细胞，发现db/db小鼠中的GLUT1，HK2和LDHA mRNA表达显著增加，与db/m小鼠相比（图1 C）。免疫荧光表明，db/db小鼠肾脏F4/80巨噬细胞中的GLUT1水平要高得多（图1 D）。此外，发现 db/db小鼠的肾巨噬细胞中IL1β和TGF-β1 mRNA水平升高（图1 C）。这些事实表明，DKD小鼠肾巨噬细胞中糖酵解增强。

图1 糖尿病肾巨噬细胞中糖酵解增加。

HSA处理的肾小管上皮细胞促进巨噬细胞糖酵解

蛋白尿是DKD进展的关键，过量的白蛋白通过肾小管上皮细胞影响巨噬细胞。为了进一步探索白蛋白处理的肾小管上皮细胞是否也会影响巨噬细胞代谢状态，实验测量了糖酵解酶的表达。巨噬细胞与HSA处理的肾小管上皮细胞（HK-2）共培养大大增强了mRNA水平的GLUT1，HK2和LDHA表达。在巨噬细胞中，HK2和LDHA的蛋白质表达变化与其mRNA表达的变化平行。此外还发现，在与HSA处理的HK-2细胞共培养后，巨噬细胞上清液中的乳酸水平显著升高。

在之前的研究中，发现HSA处理的肾小管上皮细胞通过EVs影响巨噬细胞表型。接下来进一步探索EVs在巨噬细胞糖酵解中是否是必不可少的，实验抑制了HK-2细胞衍生的EVs分泌，然后将这些细胞与巨噬细胞共培养。结果发现表明，HSA刺激的肾小管上皮细胞通过EVs影响巨噬细胞的糖酵解。

HSA处理的肾小管上皮细胞衍生的EVs促进巨噬细胞糖酵解

研究进一步证实，肾小管上皮细胞衍生的EVs会影响巨噬细胞代谢状态。因此，分离了这些EVs，并通过透射电子显微镜（图2 A）和纳米颗粒跟踪分析（图2 B）表征了它们的形态和性质。为了探索EVs是否可以被巨噬细胞内化，将Dil-C18标记的EVs与巨噬细胞共培养。结果发现，24 h 后，EVs（红色荧光）与巨噬细胞共定位（图2 C）。然后，将巨噬细胞和HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs共培养，发现巨噬细胞中的糖酵解酶增加（图2 D-F）。与HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs共培养的巨噬细胞上清液乳酸水平（图2 G） 和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA 水平（图2 D）也更高。为了进一步证实EVs通过促进巨噬细胞糖酵解来影响巨噬细胞功能，用糖酵解抑制剂2-DG处理巨噬细胞，以便与HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs共培养。如图2 H，2-DG 逆转了 IL1β 和 TGF-β1 表达的上调。

为了证实HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs在体内影响巨噬细胞糖酵解，通过尾静脉将EVs注射到小鼠体内。结果表明，大多数EVs在注射后24 h 出现在肝脏和肾脏中。此外，注射了经HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs的db/db小鼠显示出ACR水平升高（图3 A）以及肾皮质中纤维化和炎症标志物的表达（图3 B、C）和肾巨噬细胞中糖酵解的增加（图3 D、E）。这些结果表明，肾小管上皮细胞衍生的EVs可以在体外和体内影响巨噬细胞糖酵解。

图2 HSA处理的肾小管上皮细胞衍生的EVs在体外促进巨噬细胞糖酵解。

图3 HSA处理的肾小管上皮细胞衍生的EVs促进了体内巨噬细胞糖酵解。

HIF-1α 促进巨噬细胞糖酵解

根据一些报道，HIF-1α在促进糖酵解中起重要作用。因此，为了研究HIF-1α在调节巨噬细胞代谢重编程中是否是必不可少的，实验用HIF-1α siRNA转染巨噬细胞或用FG-4592（一种脯氨酰羟化酶抑制剂）处理巨噬细胞，分别下调或过表达HIF-1α。结果发现，HIF-1α SIRNA显著下调巨噬细胞GLUT1、HK2和LDHA（图4 A） 和 HK2、LDHA 蛋白（图4 B、C）表达。上清液中的乳酸盐含量（图4 D）和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA（图4 A）在HIF-1α siRNA组中也有所下降。另一方面，FG-4592上调了GLUT1，HK2和LDHA mRNA（图4 E）和 HK2 和 LDHA 蛋白（图4 F、G）表达。乳酸含量（图4 H）和IL1β和TGF-β1的水平在FG-4592组中也较高（图4 E）。这些数据表明，HIF-1α促进巨噬细胞糖酵解。

图4 HIF-1α促进巨噬细胞糖酵解。

HSA处理的肾小管上皮细胞衍生的EVs通过稳定HIF-1α促进巨噬细胞糖酵解

为了进一步证实HF-1α在HSA处理的肾小管上皮细胞诱导的巨噬细胞糖酵解中的作用，使用免疫荧光测量肾巨噬细胞中的HIF-1α水平。结果表明，db /db小鼠的肾巨噬细胞HIF-1α水平明显高于对照小鼠。此外还发现，在与HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs共培养的细胞中，巨噬细胞HIF-1α表达增加，HIF-1α羟基化程度降低，表明HK-2细胞衍生的EVs提高了HIF-1α的稳定性。而且HIF-1α在注射HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs的db / db小鼠的肾巨噬细胞中表达增加。

为了进一步证实HIF-1α参与糖酵解调节，用HIF-1α siRNA转染巨噬细胞，与HSA刺激的HK-2细胞的EVs共培养。结果发现，HIF-1α的敲低逆转了GLUT1，HK2和LDHA水平、乳酸产量以及IL1β和TGF-β1表达的增加。这些结果表明，来自HSA刺激的HK-2细胞的EVs通过HIF-1α促进巨噬细胞糖酵解。

最后，实验探索了HSA处理的HK-2细胞衍生的EVs如何调节HIF-1α的稳定性，并发现EVs中有几种被报道参与HIF-1α稳定性的miRNAs和lncRNAs增加。

总之，该研究发现，DM小鼠的肾巨噬细胞中糖酵解增强。此外，HSA通过稳定HIF-1α，通过肾小管上皮细胞衍生的EVs促进巨噬细胞糖酵解，从而诱导肾纤维化和炎症。由于白蛋白尿是DKD治疗的障碍，这项研究表明，抑制肾巨噬细胞糖酵解可能是延缓DKD进展的新方法。

参考文献：Jia Y, Chen J, Zheng Z, Tao Y, Zhang S, Zou M, Yang Y, Xue M, Hu F, Li Y, Zhang Q, Xue Y, Zheng Z. Tubular epithelial cell-derived extracellular vesicles induce macrophage glycolysis by stabilizing HIF-1α in diabetic kidney disease. Mol Med. 2022 Aug 12;28(1):95. doi: 10.1186/s10020-022-00525-1. PMID: 35962319; PMCID: PMC9373297.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35962319/

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