循环拉伸应力下人成纤维细胞早期成骨中整合素αVβ3-肌动蛋白丝轴的调控

成纤维细胞是间充质基质中常见的贴壁细胞类型。成纤维细胞和间充质干细胞具有相似的 MSC 标记，可以分化成成骨、脂肪和软骨细胞谱系。成纤维细胞和间充质干细胞的相似性支持使用成纤维细胞作为研究成骨的合适细胞类型。当干细胞处于由生物材料、生长因子和组织组成的微环境中时，适当的机械刺激可以促进干细胞的成骨分化。临床和基础研究表明，外部机械刺激，例如因拉伸而增加的张力，可以影响干细胞的成骨分化。机械转导通常通过整合素将机械刺激转化为生化信号，然后影响下游细胞活动的过程。

整合素是存在于细胞表面的跨膜受体，是由非共价键连接的α和β亚基组成的功能性异二聚体。整合素的聚集和激活募集和激活细胞内信号蛋白，如粘着斑激酶（FAK）、纽蛋白和踝蛋白，它们有助于粘着斑并影响干细胞的分化。

Yes 相关蛋白（YAP）是一种转录共激活因子，通过与可控制转录的 TEAD（TEA 结构域 DNA 结合转录因子家族）DNA 结合蛋白结合，促进细胞增殖并调节干细胞分化。研究表明，通过敲除肌动蛋白细胞骨架的调节因子或用 F-肌动蛋白抑制药物处理来控制 F-肌动蛋白水平会显著影响 YAP 活性。然而，机械刺激如何通过整合素-微丝轴影响 YAP 以调节干细胞成骨分化仍不清楚。

广东省医学生物力学重点实验室、广州医科大学第一附属医院眼科的课题组曾研究了整合素αVβ3与循环拉伸应力（CTS）诱导的早期成骨分化之间的关系。整合素αVβ3的激活导致肌动蛋白丝重排并调节核YAP的表达。此外还发现FAK参与了粘着斑的形成，整合素αVβ3介导的FAK磷酸化在CTS诱导的成骨分化早期发挥了作用。该研究表明整合素αVβ3可作为骨修复的治疗靶点。

循环拉伸应力促进成纤维细胞中的细胞增殖和成骨

研究探讨了循环拉伸应力（0.5 Hz，10%）、细胞增殖和成纤维细胞成骨分化之间的关系。首先，成纤维细胞暴露于循环拉伸应力 4 天和 7 天。如图1 a，成纤维细胞增殖响应于循环拉伸应力而增加。作为成骨分化标志物的 ALP 和 RUNX2 的蛋白质和 RNA 表达在循环拉伸应力下 7 天后增加（图1 c、d）。成纤维细胞的 ALP 染色也获得了类似的结果，在循环拉伸应力下ALP 染色更高（图1 b）。这些结果表明，循环拉伸应力促进了成纤维细胞的细胞增殖和早期成骨分化。

图1 CTS下成纤维细胞中细胞增殖、早期成骨分化和整合素αVβ3的表达。

（a）细胞增殖在 CTS 下 1 天、4 天、7 天。（b ）ALP 染色在CTS 下 4 天和 7 天。（c）ALP和RUNX2蛋白表达在CTS下4天和7天。（d ）ALP和RUNX2 mRNA表达在CTS下4天和7天。（e）整合素αVβ3 mRNA表达在CTS下4天和7天。（f）整合素 αVβ3 的免疫荧光在 CTS 下 7 天。

循环拉伸应力诱导的早期成骨分化依赖于整合素αVβ3的表达和激活

为了探索整合素是否参与循环拉伸应力诱导的成骨分化和细胞增殖，通过qRT-PCR和免疫荧光分析了整合素αVβ3在成纤维细胞中的表达。实验发现整合素αVβ3的表达在循环拉伸应力下增加（图1 e、f），表明循环拉伸应力促进整合素αVβ3的表达。因此，研究了循环拉伸应力下整合素αVβ3与成骨分化之间的关联。为了确定循环拉伸应力是否以整合素αVβ3依赖性方式刺激成骨分化，整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗剂shRNA或RGDyk抑制。如图2 a，当成纤维细胞中整合素αV或β3的表达下调时，循环拉伸应力下细胞增殖减少。

然后，通过 ALP 染色、蛋白质印迹和 qRT-PCR 检测整合素 αVβ3 对成骨分化的影响。shRNA-整合素αV和β3组的ALP染色比CTS组少（图2 b）。蛋白质印迹显示，在成纤维细胞中整合素αVβ3表达下调后，ALP和RUNX2的蛋白质表达降低（图2 c、e）。通过 qRT-PCR 获得了类似的结果，当整合素 αVβ3 表达被抑制时，ALP 和 RUNX2 mRNA 的表达降低（图2 d、f）。这些结果表明，循环拉伸应力通过整合素αVβ3促进成纤维细胞的早期成骨分化和细胞增殖。

图2 CTS 通过整合素 αVβ3 调节细胞增殖和早期成纤维细胞成骨分化。

（a）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3组在CTS下的细胞增殖。（b）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3组在CTS下的ALP染色。（c）在 GM 和 RGDyk 组中 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白质表达。（d）GM 和 RGDyk 组在 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表达。（e）在 CTS 下GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 组中 ALP 和 RUNX2 的蛋白质表达。（f） CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 组中 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表达

成骨过程中通过整合素αVβ3调节循环拉伸应力的肌动蛋白丝

为了更好地了解循环拉伸应力下整合素αVβ3与肌动蛋白丝之间的关联，实验检测了整合素αVβ3被抑制时β-肌动蛋白的表达。蛋白质印迹和qRT-PCR显示β-肌动蛋白的表达在循环拉伸应力下增加。当整合素 αVβ3 的表达受到抑制时，RGDyk 组中 β-肌动蛋白的表达低于 CTS 组。还发现 shRNA-整合素 αV 或 β3 组中 β-肌动蛋白的表达低于 CTS 组。免疫荧光显示，微丝应力纤维在循环拉应力作用下呈网状分散在靠近细胞膜的结构中。当整合素αVβ3的表达受到抑制时，微丝应力纤维以与GM（培养基）组相似的拉长方式排列。这些结果表明，循环拉伸应力上调β-肌动蛋白的表达并通过整合素αVβ3改变肌动蛋白丝的结构。

为了研究肌动蛋白丝是否参与由循环拉伸应力诱导的成骨分化，使用细胞松弛素D 来抑制肌动蛋白丝的聚合。蛋白质印迹显示，在循环拉伸应力下，细胞松弛素D降低了ALP和RUNX2的表达。这些结果表明，循环拉伸应力通过整合素αVβ3-微丝轴调节成纤维细胞成骨分化的早期阶段。

成骨过程中通过整合素αVβ3-微丝轴调节循环拉伸应力核YAP

实验还探讨了循环拉伸应力是否通过整合素αVβ3-微丝轴调节核YAP 的表达。蛋白质印迹和qRT-PCR显示核YAP的表达在循环拉伸应力下增加。当整合素αVβ3的表达受到抑制时，蛋白质印迹显示核YAP的表达低于CTS组。免疫荧光结果显示，在循环拉应力作用下，核YAP的表达明显增加。此外还发现，当整合素 αVβ3 被抑制时，核YAP 的表达降低。这些结果表明，循环拉伸应力通过整合素αVβ3上调核YAP。

当细胞松弛素D 抑制 β-肌动蛋白的聚合时，蛋白质印迹和免疫荧光显示核YAP 的表达在循环拉伸应力下降低。蛋白质印迹还显示，在维替泊芬存在下，在循环拉伸应力下ALP和RUNX2的表达降低。上述实验表明，在成骨分化早期，循环拉伸应力通过整合素αVβ3-微丝轴调节核YAP。

循环拉伸应力促进成骨过程中粘着斑的形成和 FAK 磷酸化

由肌动蛋白丝和整合素形成的粘着斑需要踝蛋白（talin）、FAK 和纽蛋白（vinculin）才能将 CTS 传递到基底。实验检测了 talin-1、FAK 和 vinculin 的表达，以探索它们与整合素 αVβ3 的关联。蛋白质印迹和qRT-PCR显示在循环拉伸应力下talin-1、FAK和vinculin的表达增加（图3 a、b）。蛋白质印迹显示，当整合素αVβ3的表达被c（RGDyk）或shRNA抑制时，talin-1，FAK和vinculin的表达降低（图3 c、e）。qRT-PCR 获得了类似的结果（图3 d、f）。免疫荧光显示，纽蛋白在循环拉伸应力下的可见粘着斑斑块中表达和定位更高。整合素αVβ3的抑制与纽蛋白表达的显著降低相关（图3 g）。这些结果表明，循环拉伸应力通过整合素αVβ3促进粘着斑的形成。

接下来，研究了 FAK 磷酸化在循环拉伸应力下在成骨分化中的作用。蛋白质印迹显示FAK的磷酸化响应于循环拉伸应力而增加，并且整合素αVβ3的抑制下调了FAK的磷酸化（图3 h、i）。实验发现，当 FAK 的磷酸化被 Y-15（一种小分子抑制剂）抑制时，ALP 和 RUNX2 的表达降低（图3 j）。这些结果表明，FAK不仅参与了含有整合素αVβ3的粘着斑的形成，而且FAK的磷酸化有助于循环拉伸应力诱导的成骨分化的早期阶段。

图3 CTS 诱导的整合素 αVβ3 激活调节粘着斑相关蛋白和 FAK 的磷酸化，以促进成骨分化的早期阶段。

（a）talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白质表达在 CTS 下 4 天和 7 天。（b）talin-1、FAK和vinculin mRNA表达在CTS下4天和7天。（c）GM 和 RGDyk 组中 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白质表达。（d）GM 和 RGDyk 组在 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的 mRNA 表达。（e）在 CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素αV 和 shRNA-整合素 β3 组中 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白质表达。（f）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3组在CTS下talin-1、FAK和vinculin的mRNA表达。（g） GM、CTS、NC、shRNA-integrin αV 和 shRNA-integrin β3 组在 CTS 下的 vinculin 免疫荧光 7 天。（h） CTS 下 FAK 磷酸化水平 7 天。（i）CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 组中 FAK 的磷酸化水平。（j）CTS下CTS组和Y15组ALP和RUNX2蛋白表达。

总之，循环拉伸应力通过整合素αVβ3的激活对成纤维细胞早期成骨分化产生积极影响，导致微丝细胞骨架的重排。此外，循环拉伸应力刺激的肌动蛋白丝的重排和 FAK 的磷酸化通过整合素 αVβ3 导致人成纤维细胞中核 YAP 的表达增加。在未来的研究中，整合素αVβ3应该被认为是体内实验的一个有希望的靶点，以验证其促进骨修复的功能。

参考文献：Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34620239/

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