骨化三醇对人自然杀伤细胞的体外抗衰老作用研究

许多研究发现，衰老对多种疾病有直接影响，如传染病、心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症等。机体衰老伴随着免疫衰老。衰老的共同特征主要包括慢性低度炎症、基因组不稳定、蛋白质表达失衡、线粒体失活、细胞衰老和细胞间通讯改变。

自然杀伤细胞（NK细胞）作为先天免疫的主要成分，在抗感染、抗肿瘤、调节免疫系统等方面发挥着重要作用。当免疫系统老化时，表面活化受体如自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）、表面标记分化簇57（CD57）、分化簇16（CD16）的表达增加。这些分子可以激活NK细胞的杀伤功能，从而导致老年人的细胞失衡和炎症。同时，NK细胞的抑制分子如自然杀伤细胞2族A（NKG2A）、自然杀伤细胞2族C（NKG2C）和自然细胞毒性受体（NCRs）减少。其他与 NK 细胞衰老相关的标志物是 T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域分子3（TIM3）和程序性细胞死亡-1（PD-1）增加。免疫衰老过程中 PD-1 和 TIM3 的上调可能会抑制 NK 细胞的功能并导致 NK 细胞耗竭。

导致免疫衰老的另一个因素是免疫炎症。据报道，NK 细胞释放的高水平炎性细胞因子会导致 DNA 损伤、氧化应激和细胞衰老。此外，NK细胞的细胞失衡和炎症状态可能导致自身免疫性疾病。

维生素 D 在人体内以两种活性形式存在，即维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（骨化三醇）。已知骨化三醇可抑制 B 细胞和 T 细胞中 TNF-α、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和其他炎性细胞因子的产生。它还可以释放抗炎细胞因子如 IL-4 和 IL-10 并调节自噬以抵抗炎症细胞浸润。

已发表的数据表明，氧化应激影响细胞中的多种信号通路，包括 SIRT1、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通路。SIRT1基因被认为是一种长寿基因，抑制该基因会导致与蛋白质表达、细胞周期和代谢相关的疾病。SIRT1-ΔExon8是SIRT1的一种新型剪接异构体，通过交替剪接存在于哺乳动物中。SIRT1-ΔExon8 也被认为是全长 SIRT1 的共同调节因子。

目前很少有研究关注衰老和氧化衰老对 NK 细胞的影响。骨化三醇对 SIRT1-ΔExon8 的影响也报道甚少。因此，深圳大学第三附属医院（罗湖区人民医院）肿瘤康复科及医学检验科、中国医学科学院肿瘤医院深圳医院肝胆外科、中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院的一项研究旨在探索骨化三醇对 NK 细胞衰老和氧化衰老的影响，因为这些细胞在人类先天免疫系统中占据中心位置。

骨化三醇逆转了表面衰老标志物的表达，减缓了 NK 细胞的扩增，并使 NK 细胞保持在 G1 期。

衰老的 NK 细胞表现出与衰老相关的生物标志物（如 CD16、PD-1、TIM3 和 KIR）的高表达，而 NKG2A 的低表达。实验发现在用骨化三醇处理 72 h 后，衰老相关生物标志物 NKG2A 的表达水平增加（图1 a），而 CD16（图1 b）、TIM3（图1 c）、PD-1（图1 d）和 KIR（图1 e）降低。逆转效应与骨化三醇的浓度呈正相关。

实验在体外从人类外周血样本中扩增细胞，分离出 NK 细胞（CD3-CD56+）（图 1f），然后与不同浓度的骨化三醇或雷帕霉素一起培养 72 h。CCK8染色结果显示，高浓度骨化三醇处理的NK细胞生长速度慢于阴性对照组（NC）（图 1g）。此外，骨化三醇调节 NK 细胞周期。用骨化三醇处理 48 h 后，NK 细胞表现出高度骨化三醇浓度依赖性，向 G1 期移动，而 G2 期细胞比例下降。无论骨化三醇的浓度如何，处理的 NK 细胞在 S 期的比例没有变化（图1 h）。然后测试了这种骨化三醇衍生的 G1 期阻滞是否诱导 NK 细胞凋亡，发现 NK 细胞凋亡生物标志物、T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）结构域（TIGIT）没有显著变化（图1 i）。这些结果表明，骨化三醇的添加降低了 NK 细胞的生长速度，降低了它们的增殖，并诱导了 NK 细胞的 G1 期停滞而不是引起细胞凋亡。

图1 NK细胞的衰老相关表型、细胞扩增和细胞周期分析。

骨化三醇降低NK细胞炎性细胞因子的释放，抑制NK细胞的细胞毒性

炎症是一种慢性低度炎症。它加速了 NK 细胞的衰老，因为 NK 细胞参与了这种慢性炎症。图2 a表明所有组的 IL-5、IL-13、IFN-γ 和 TNF-α 水平均显著低于阴性对照组。IFN-γ 和 TNF-α 是众所周知的促炎细胞因子，但一些研究也显示了 IL-5 的促炎特性。

然而，NK细胞的细胞毒性主要涉及炎性细胞因子的释放和细胞的脱粒。实验用 DIO 标记 K562 细胞，并将 DIO-K562 细胞与骨化三醇处理的 NK 细胞共培养 4 h。DIO⁺ PI⁺ 细胞百分比在所有效应因子（E）/靶因子（T）组中低于阴性对照组（图2 b、c）。分化簇107（CD107）的表达表明脱粒率较低（图2 d）。这些结果表明，骨化三醇对NK杀伤功能的抑制作用。

图2 骨化三醇对NK细胞功能的影响。

骨化三醇激活 SIRT1-ΔExon8 和抗衰老相关 SIRT1/pERK 通路的表达

为了研究骨化三醇对 NK 细胞的抗衰老作用，检测了与衰老相关的信号通路。蛋白质印迹分析以评估骨化三醇处理的 NK 细胞中 VDR、SIRT1-ΔExon8、SIRT1 和 PERK 的表达水平。统计分析表明骨化三醇在高浓度下激活 VDR/SIRT1/pERK 轴。同时，骨化三醇激活了 SIRT1-ΔExon8 的表达（图3 a）。

图3 骨化三醇对 NK 细胞的抗衰老作用。

骨化三醇在体外抗氧化应激诱导的NK细胞衰老

由于多年来发现的大量证据，人们普遍认为衰老是由氧化损伤积累引起的。实验用不同浓度的 H₂O₂ 培养NK细胞24 h，发现100 μM是最接近中位致死剂量（LD₅₀）的浓度（图3 b）。NK细胞群中TIM3的表达随着H₂O₂ 的加入而增加，而在骨化三醇处理后表达降低（图3 c）。此外，老化的 NK 细胞在存在 β-半乳糖苷酶的情况下被染成蓝色。细胞的这种蓝色是衰老细胞的特定标志。统计分析表明，未经处理的 NK 细胞具有较低的细胞 β-半乳糖苷酶活性，而暴露于 H2O2的 NK 细胞显示出升高的 β-半乳糖苷酶活性。骨化三醇减少了β-半乳糖苷酶阳性群体，表明存在较少的老化细胞（图3 d）。

在研究中还评估了 NK 细胞的线粒体膜电位。结果表明，与未处理的细胞相比，H2O2显著降低了NK细胞的细胞活性，而骨化三醇增加了H2O2引起的细胞损伤（图3 e）。

图4 骨化三醇对 NK 细胞的抗凋亡作用。

骨化三醇体外抗氧化应激诱导的NK细胞凋亡

接下来，测量了凋亡细胞的数量。流式细胞仪结果显示，用100 μM H2O2处理24 h导致NK细胞显著凋亡。然而，骨化三醇处理降低了细胞凋亡率（图4 a）。

以上结果均表明，骨化三醇对H2O2引起的氧化应激具有抗性。然而，在氧化应激下检测到 NK 细胞中的凋亡蛋白。H2O2处理后凋亡相关蛋白caspase-3 p17和caspase-3 p20的水平显著增加。骨化三醇减少 H2O2诱导的细胞凋亡，下调 caspase-3 p17 和 caspase-3 p20 的表达（图4 b）。这些结果表明，骨化三醇能够抵抗H2O2诱导的细胞凋亡。

在这项研究中，展示了骨化三醇对 NK 细胞的抗衰老作用。骨化三醇逆转了 NK 细胞上衰老生物标志物的表达。它减慢了 NK 扩增并使它们保持在 G1 期。此外，骨化三醇抑制炎性细胞因子的释放并下调NK细胞的脱粒。由此可见，骨化三醇激活 SIRT1-ΔExon8 和 VDR/SIRT1/pERK 轴可能是骨化三醇抗衰老作用的主要机制。最后，骨化三醇在体外抵抗NK细胞的氧化衰老。

参考文献：Li W, Che X, Chen X, Zhou M, Luo X, Liu T. Study of calcitriol anti-aging effects on human natural killer cells in vitro. Bioengineered. 2021 Dec;12(1):6844-6854. doi: 10.1080/21655979.2021.1972076. PMID: 34546851; PMCID: PMC8806577.

原文链接：http://group9-s.ccame.net/34546851/

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