循环拉伸通过心房成纤维细胞中的 microRNA-208a 促进 microRNA-499 调节 Bcl-2

microRNA 是一种含有约 22 个核苷酸的小型非编码 RNA 链，它们能通过与靶 mRNA 的3′UTR（非编码区）完全互补导致 mRNA 降解。已知MicroRNAs（miRNA）广泛参与心血管疾病发病机制中的基因调控，包括心肌细胞肥大、纤维化和凋亡。 全球 miRNA 表达谱已在心脏中鉴定出 miRNA-499（miR-499）、miRNA-208a（miR-208a），这些 miRNAs 在应对应激的心肌细胞肥大和纤维化中起重要作用。

与其他 RNAs 一样，miRNA 也是转录的产物。因此，一种 miRNA 可以调节另一种 miRNA 的表达。 miR-499 对 miR-208a 的调节增加了 miR-499 调节的心脏 microRNA 的数量。

B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）在人体中由BCL2基因编码，是 Bcl-2 调节蛋白家族的创始成员，也是线粒体细胞死亡途径的关键调节成分。Bcl-2 位于线粒体外膜，在促进细胞存活和抑制促凋亡蛋白方面发挥重要作用。

病理条件下心房成纤维细胞的增殖在心房电重构和心房结构重构中起重要作用。研究报道，心房心脏成纤维细胞通过间隙连接施加电紧张，影响心肌细胞的电耦合性形式并引起心房颤动。对培养细胞进行与体内动态拉伸超负荷相当的体外各种水平的循环机械拉伸已得到很好的研究，包括研究心肌细胞、血管平滑肌细胞和新生大鼠心肌细胞中基因表达和信号转导的分子机制的研究。然而，机械拉伸对心房心脏成纤维细胞的影响鲜有报道。

拉伸的心房心脏成纤维细胞和血流动力学超负荷心脏中 miR-499、miR-208a 和 Bcl-2 之间的关系尚未明确。此外，miR-499 和 miR-208a 诱导拉伸的心房心脏成纤维细胞凋亡的分子调控机制仍然知之甚少。因此，台湾天主教辅仁大学医学院、新光医院心脏内科及急诊科的一项研究旨在探讨调节 miR-499 和 miR-208a 对拉伸的心房成纤维细胞和容量超负荷诱发心力衰竭大鼠模型中 Bcl-2 蛋白表达的分子机制。

机械拉伸抑制人心脏成纤维细胞-成人心房中的 miR-208a，但增强 miR-499 和 Bcl-2 mRNA 和蛋白质的表达

实时定量聚合酶链反应（PCR）用于测量 miR-208a 和 miR-499 水平，以检查机械拉伸对人心脏成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）中 miR-208a 和 miR-499 的影响。1 Hz，20% 伸长率的机械拉伸持续 0.5-2 小时导致 miR-208a 表达显著高于对照细胞，然而，拉伸 4-8 小时将 miR-208a 的表达恢复到控制水平（图1 A）。机械拉伸 2-8 小时导致 miR-499 显著升高（图1 B）。此外，拉伸 1 h 时 Bcl-2 mRNA 的表达显著低于对照，机械拉伸 2-8 h 时 Bcl-2 mRNA 和蛋白质上调（图1 C-E）。

图1 机械拉伸抑制了人心肌成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）中的miR-208a，但增强了miR-499，Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的表达。

MiR-499 降低拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 荧光素酶活性

实验发现，位于 pri-miR-208a 基因位点下游 57bp的人类 pri-miR-208a ，具有 miR-499-5p 的结合位点。机械拉伸 1 小时显著增加 HCF-aa 中的 pri-miR-208a 荧光素酶活性。然而，用 miR-499 预处理抑制了拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 荧光素酶活性的表达。pri-miR-208a 上 miR-499 结合位点的突变通过 1 小时的拉伸消除了对 pri-miR-208a 荧光素酶活性的抑制。这些发现表明，pri-miR-208a 是 miR-499 的靶标。

机械拉伸通过 miR-208a 抑制 Bcl-2-3'UTR 荧光素酶活性

Bcl-2-3'UTR 包含 miR-208a 结合位点，而突变体 Bcl-2-3'UTR 具有 miR-208a 结合位点的突变。荧光素酶报告基因分析显示，机械拉伸 1 小时可抑制 Bcl-2-3'UTR 荧光素酶活性。然而，这种效应被 Bcl-2-3'UTR 中 miR-208a 结合位点的突变抑制。添加 antagomir-208a 增强了拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2-3'UTR 荧光素酶活性，但对突变体 Bcl-2-3'UTR 没有影响。添加突变型 miR-208a 对 Bcl-2-3'UTR 荧光素酶活性没有影响。这些结果表明，Bcl-2-3'UTR 中的 miR-208a 结合位点对于机械拉伸诱导的转录调控至关重要。

MiR-499 抑制拉伸的 HCF-aa 中 miR-208a 的表达

与单独拉伸相比，miR-499 过表达显著抑制了机械拉伸 1 小时的 HCF-aa 中 miR-208a 的表达（图2 A）。然而，添加突变型 miR-499 或 antagomir-499 并没有抑制 miR-208a 的表达。添加 antagomir-499 通过 4 小时的拉伸减弱了 miR-208a 的下调（图2 B）。这些发现表明，miR-208a 表达的下调可能是由于机械拉伸过程中 miR-499 的上调所致。

图2 miR‐499通过miR-208a影响Bcl-2 mRNA和蛋白质在拉伸的人心肌成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）中的表达。

机械拉伸通过 miR-208a 影响 Bcl-2 mRNA 和蛋白质的表达

与单独拉伸相比，添加 miR-208a 显著抑制机械拉伸 4 h 诱导的 Bcl-2 mRNA 和蛋白质的表达（图2 C-E），而添加突变型 miR-208a 或 antagomir-208a 对这种 Bcl-2 表达没有影响。与单独拉伸相比，Bcl-2小干扰RNA（siRNA）抑制机械拉伸4小时诱导的Bcl-2 mRNA和蛋白质的表达，而添加乱序siRNA对这种抑制作用没有影响。用野生型 miR-208a 预处理对没有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表达没有影响。

免疫组织化学染色证实机械拉伸 4 小时后 HCF-aa 中 Bcl-2 表达增加（图3 A、B）。添加野生型 miR-208a 抑制了 Bcl-2 表达，而用突变型 miR-208a 或 antagomir-208a 预处理没有影响（图3 C–E）。野生型 miR-208a 对没有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表达没有影响（图3 F）。添加 Bcl-2 siRNA 在拉伸 4 小时后抑制 HCF-aa 中 Bcl-2 的表达，而添加乱序 siRNA 对这种抑制没有影响（图3 G、H）。这些结果表明，机械拉伸 4 小时会通过 miR-208a 影响 Bcl-2 的表达。

图3 免疫组织化学染色证实了Bcl-2在人心肌成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）中的表达。

图4 荧光素异硫氰酸酯-膜联蛋白V在各种条件下对人心肌成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）的分析。

MiR-499 通过 miR-208a 调节 AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 的表达

在主动脉腔静脉（AV）分流的成年大鼠中诱导容量超负荷，研究了 miR-499 和 miR-208a 对体内 Bcl-2 表达的影响。AV 分流导致心肌 miR-208a 表达从 3 天到 5 天显著增加，但从 7 天到 14 天下降（图5 A）。此外，miR-499 的表达从 7 天增加到 14 天（图5 B）。野生型 miR-499 过表达在 5 天时显著降低了 miR-208a 的表达，但添加突变型 miR-499 和 antagomir-499 对 miR-208a 的表达没有影响（图5 C）。

与假手术大鼠相比，AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表达在 7 至 14 天显著被诱导（图5 D–F）。进行 AV 分流 14 天后，大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表达显著增加（图5 G–I）。用 miR-208a 预处理显著抑制了这种增加，而添加突变型 miR-208a 和 antagomir-208a 没有影响。与 AV 分流大鼠相比，用 Bcl-2 siRNA 预处理可抑制心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白的表达，而添加乱序 siRNA 对这种抑制没有影响。这些发现表明，miR-208a 的表达可以受 miR-499 的调节，并且可以调节容量超负荷大鼠心脏中 Bcl-2 的表达。

图5 miR‐499通过miR‐208a在具有AV分流的大鼠中调节心肌Bcl-2表达。

图6 miR‐208a通路通过人心肌成纤维细胞-成人心房（HCF-aa）中miR-499介导了Bcl-2表达。miR-499的关键作用可能为心血管疾病的microRNA靶向治疗带来潜在的应用前景。

总之，研究发现 miR-208a 是 miR-499 的直接靶标，并且 miR-208a 的抑制缓解了机械拉伸的 HCF-aa 中 Bcl-2 的抑制（图6），还观察到 antagomir-208a 过表达增强了容量超负荷诱导的心力衰竭模型中 Bcl-2 的表达。microRNA 介导的 microRNA 调控的结果是 microRNA 靶向的心血管治疗的潜在新应用。

参考文献：Chua SK, Wang BW, Yu YJ, Fang WJ, Lin CM, Shyu KG. Cyclic stretching boosts microRNA-499 to regulate Bcl-2 via microRNA-208a in atrial fibroblasts. J Cell Mol Med. 2021 Mar;25(6):3113-3123. doi: 10.1111/jcmm.16373. Epub 2021 Feb 18. PMID: 33605072; PMCID: PMC7957261.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33605072/

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