Nrf2 的激活通过 PI3K/Akt 通路和 HO1-SOD2 相互作用参与牙周膜干细胞的循环机械应力刺激的成骨分化

正畸牙齿移动过程中的生物学基础是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一个连续的、复杂的、协调的生物学过程，涉及成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收。人牙周膜干细胞（PDLSCs）的机械应力刺激的成骨分化是正畸中张力侧牙槽骨重塑的重要组成部分。

之前的研究表明，在循环机械应力刺激的 PDLSCs 成骨分化过程中，活性氧（ROS）水平升高，并诱导核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）及其下游分子如血红素加氧酶1（HO-1）和醌NADH脱氢酶1（NQO1）的表达。

Nrf2作为主要的转录调节因子，通过调节包括HO1和NQO1在内的抗氧化成分的表达和活性，对内源性抗氧化反应和细胞防御具有关键作用。许多信号通路对于调节 Nrf2 活性至关重要，例如蛋白激酶 C（PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和 p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。

山东大学口腔医院口腔正畸科、山东省口腔组织再生重点实验室和山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室的一项研究旨在通过基于串联质量标签 (TMT) 的液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 分析探索 Nrf2 潜在的循环机械应力刺激成骨分化的机制，将 Nrf2 激活剂叔丁基对苯二酚（t-BHQ）应用于正畸大鼠，通过免疫组织化学（IHC）染色检测成骨标志物的表达水平，以证实 Nrf2 可能是改善正畸中牙槽骨重塑的有希望的治疗靶点。

接下来，为了确认在循环机械应力刺激的成骨分化过程中 PI3K/Akt 信号通路参与 PDLSC 中 Nrf2的激活，基于 KEGG 通路分析，在研究中应用了 LY294002。循环机械应力增加了 Akt的磷酸化（p-Akt），而 PI3K 抑制剂 LY294002 抑制了 p-Akt 的水平（图1 A）。LY294002下调Nrf2的mRNA、细胞质和核蛋白表达水平（图1 B、C）。

然后测量了PDLSCs 中有或没有 LY294002 的情况下，循环机械应力刺激的成骨分化能力。数据显示，LY294002抑制成骨相关标志物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白表达水平（图1 D、E）。并且LY294002使HO1 的mRNA和蛋白表达水平降低。上述结果表明，循环机械应力刺激的 PDLSCs 成骨细胞分化中，PI3K/Akt 通路与调节Nrf2 表达有关。

图1 循环机械应力刺激下的PDLSCs成骨分化过程中，PI3K/Akt信号通路参与Nrf2激活

（A）基于蛋白质印迹实验，PI3K抑制剂LY294002在循环机械应力下抑制p-Akt水平。（B） LY294002在循环机械应力下下调PDLSCs中Nrf2 mRNA水平。（C） LY294002降低了循环机械应力下PDLSCs中Nrf2的细胞质基质和核蛋白表达水平。 （D） LY294002抑制了循环机械应力下PDLSCs中成骨相对标记物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的mRNA水平。（E）LY294002抑制了循环机械应力下PDLSCs中成骨相对标记物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的蛋白质表达水平。（F）Co-IP实验表明，PDLSCs中Akt和Nrf2之间的蛋白质-蛋白质相互作用分别与抗Akt抗体和抗Nrf2抗体进行免疫沉淀以富集蛋白质复合物。

为了进一步证实在循环机械应力过程中，PI3K/Akt 信号通路在 PDLSCs 中 Nrf2 激活的参与，在随后的研究中使用了 STRING 数据库。结果发现，Akt 和 Nrf2 之间潜在的蛋白质-蛋白质相互作用可能与该过程有关。用抗 Nrf2 抗体进行免疫沉淀实验以富集含有 Nrf2 的蛋白质复合物，然后用抗 Akt 抗体进行蛋白质印迹。结果表明，Akt存在于含有Nrf2的复合物中（图1 F）。这些数据进一步表明，在循环机械应力刺激的成骨分化过程中，PI3K/Akt 信号通路参与了 PDLSCs 中 Nrf2 的激活。

其次，在基于 TMT 的 LC-MS/MS 分析的差异表达蛋白质中，HO1 和 SOD2（Nrf2 的下游抗氧化因子）之间潜在的蛋白质-蛋白质相互作用可能与循环机械应力诱导的成骨细胞分化有关。之前的研究表明，循环机械应力促进了 Nrf2 及其下游抗氧化剂 HO1 的表达。以下研究中评估了 PDLSCs 中 SOD2 的表达。数据显示，SOD2 的 mRNA 和蛋白表达在循环机械应力过程中上调（图2 A-C）。这些数据表明，PDLSCs中HO1和SOD2之间的潜在相互作用可能与循环机械应力刺激的成骨细胞分化有关。

为了进一步证实在循环机械应力过程中HO1和SOD2的相互作用参与PDLSCs，进行了Co-IP实验。用抗 HO1 抗体进行免疫沉淀实验以富集含有 HO1 的蛋白质复合物，然后用抗 SOD2 抗体进行蛋白质印迹，数据显示 SOD2 存在于含有 HO1 的复合物中。根据 Co-IP 实验的结果（图2 D），证实了HO1和SOD2之间的相互作用与循环机械应力刺激的成骨分化有关。

图2 循环机械应力刺激下 PDLSCs 中HO1 和 SOD2的蛋白质-蛋白质相互作用。

（A）循环机械应力期间PDLSCs中SOD2的免疫荧光染色。（B）根据RT-PCR的结果，循环机械应力上调PDLSCs中SOD2 mRNA的表达。（C）根据蛋白质印迹的结果，循环机械应力促进了SOD2蛋白在PDLSCs中的表达。（D）Co-IP实验表明，PDLSCs中HO1和SOD2之间的蛋白质-蛋白质相互作用分别作为抗HO1抗体和抗SOD2抗体的免疫沉淀来富集蛋白质复合物。

之前的研究表明，Nrf2 对循环机械应力刺激的成骨细胞分化具有积极作用。最后为了验证 Nrf2 可能是正畸治疗中一个有前途的治疗靶点，实验将 t-BHQ、Nrf2 激活剂和 FDA 批准的食品添加剂应用于正畸大鼠，通过IHC染色检测PDL中成骨相关标志物的表达水平。结果表明，T-BHQ可促进正畸大鼠张力侧PDL中Nrf2及其下游抗氧化剂HO1的表达。t-BHQ 处理正畸大鼠中 ALP 和 COL1（成骨相关标志物）的表达水平上调。这些结果表明，Nrf2 可能是有希望的治疗干预靶点，对正畸中的牙槽骨重塑具有积极作用。

总之，Nrf2 激活通过 PI3K/Akt 通路和 HO1-SOD2 相互作用参与 PDLSCs 中循环机械应力刺激的成骨分化。Nrf2 激活剂 T-BHQ 增强了正畸大鼠张力侧成骨标志物的表达水平。Nrf2可能是改善正畸治疗中牙槽骨重塑的潜在且有希望的治疗靶点。

参考文献：Xi X, Li Z, Liu H, Chen S, Liu D. Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 6;9:816000. doi: 10.3389/fcell.2021.816000. PMID: 35071244; PMCID: PMC8770743.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35071244/

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