层流和他汀类药物的多效性取决于 Krüppel 样因子诱导的 lncRNA MANTIS

大多数人类基因组被差异化和动态转录以产生非编码RNA，其中大部分属于长链非编码RNA（lncRNA），是长度超过 200 个核苷酸且未被翻译的 RNA 转录物。尽管已鉴定出许多 lncRNA，但只有少数lncRNA 被研究与内皮细胞稳态或血管疾病发展有关。

lncRNA MANTIS 通过SWG / SNF染色质重塑复合物的催化亚基BRG1，促进与血管生成基因和 BRG1 刺激因子 BAF155 的相互作用，反式作用于血管生成。此外，MANTIS 表达在特发性肺动脉高压患者中下调，而在人胶质母细胞瘤的内皮细胞中表达上调。MANTIS在动脉粥样硬化饮食的猴子的血管再生过程中也被上调。表观遗传学上， MANTIS 的表达受到 H3K4 组蛋白去甲基化酶 JARID1B 的抑制。调控MANTIS 表达的转录因子以及MANTIS 在内皮信号传导中的作用尚未确定。

基于此，德国歌德大学心血管生理学研究所、马克斯-普朗克心肺研究所等联合课题组的一项研究旨在确定MANTIS 的转录调控，以及它在内皮功能障碍和血管疾病发展中的可能作用。此外分析了MANTIS在对他汀类药物和层流的内皮反应过程中的作用。文章名为《Pleiotropic effects of laminar flow and statins depend on the Krüppel-like factor-induced lncRNA MANTIS》。

MANTIS有助于流动诱导的内皮基因诱导

层流通过诱导像 lncRNA Mantis 这样的保护性血管基因来维持内皮细胞的静止。为了确定内皮流动诱导的基因表达是否受到MANTIS的影响，在用对照 siRNA 或指向MANTIS的 siRNA 处理后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）经受层流（48 h，20 dynes/cm2）进行 RNA 测序。

MANTIS 下调对流量诱导的内皮基因表达有显著影响，特别是在基因本体术语“血管EC迁移”中富集基因的表达（图1 A）。通过 RT-qPCR 确认了细胞间粘附分子1（ICAM-1）、基因间长非蛋白质编码RNA 920（LINC00920）、胶原蛋白III 型 Alpha 1 链（COL3A1）和信号素3A（SEMA3A）的顶部调控基因（图1 B）。有趣的是，MANTIS 减弱了 ICAM-1 转录（图1 C）在静态条件、层流期间以及在细胞因子肿瘤坏死因子α的响应中（图1 D）。使用 dCas9-VP64 CRISPR 激活系统增加 MANTIS 的表达证实 MANTIS 限制 ICAM-1 表达，因为 MANTIS 的上调降低了 ICAM-1 表达（图1 E、F）。这种效应伴随着在 MANTIS 敲低后 ICAM-1 转录起始位点（TSS）的染色质可及性的相应增加（图1 G）。

为了鉴定MANTIS的功能活性结构域，克隆了MANTIS的不同突变体，其中一个突变体只含有 Alu 元件，并在 HUVEC 中过表达。除了 MANTIS 全长（FL）结构外，只有 MANTIS-Alu 元素能够抑制 ICAM-1 表达。两个 N-末端缺失（ΔN1、ΔN2）构建体对 ICAM-1 表达没有影响，而 C-末端缺失（ΔC）却增加了 ICAM-1 表达（图1 H）。事实上，MANTIS 的下调导致 BRG1 被募集到 ICAM-1 TSS（图1 I），这被认为可以增强 ICAM-1 的表达。因此，MANTIS 通过抑制 BRG1 与 ICAM-1 TSS 的结合来限制 ICAM-1 的表达。

图1 MANTIS 在层流过程中抑制 ICAM-1 转录。

层流增加MANTIS表达

微滴式数字PCR（ddPCR）表明，流动导致人类内皮细胞中MANTIS丰度增加近六倍（图2 A、B）。使用RNAscope进行RNA原位杂交证实了内皮细胞核中流动诱导的MANTIS增加（图2 C）。这种效应在不同物种之间是保守的：当小鼠肺内皮细胞（mLEC）暴露于层流时，MANTIS被诱导近100倍（图2 D）。MANTIS表达的增加与其TSS附近的MANTIS启动子区域的开放有关（图2 E）。同时，组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）增加，这是活性基因启动子的表观遗传标记（图2 F），并且与暴露于层流的细胞中 RNA 聚合酶 II 与MANTIS TSS 的结合增加有关（图2 G）。

图2 层流诱导MANTIS的表达。

KLF2 和 KLF4 介导流动诱导的MANTIS表达

Krüppel样转录因子KLF2和KLF4是层流诱导基因表达的介质，因此可能控制MANTIS的表达。在静态和流动条件下，KLF2 或 KLF4 的 RNA 干扰降低了 HUVECs 和 HAoEC 中MANTIS的表达（图3 A、B），而KLF2和KLF4的过表达诱导了MANTIS的表达（图3 C）。

在层流过程中，染色质免疫沉淀实验发现KLF2和KLF4与MANTIS启动子的结合增加（图3 D）。对MANTIS启动子上假定的转录因子结合位点的搜索显示，在TSS上游的1000个核苷酸区域内有6个KLF结合位点（图3 E）。KLF4或KLF2的过表达，但不是KLF9，增加了MANTIS的启动子活性（图3 F、G）。

对于KLF4，实验命名为732的基序的突变破坏了MANTIS启动子活性（图3 F）。对于KLF2，KLF结合位点的单次，三重和五重突变仅略微影响MANTIS启动子活性，并且只有所有假定的结合位点的突变才会消除KLF2介导的MANTIS启动子活性的增加（图3 G）。这些数据表明，KLF2和KLF4结合并激活MANTIS启动子。

图3 MANTIS 表达由 KLF2 和 KLF4 介导。

MANTIS是由他汀类药物（HMG-CoA还原酶抑制剂）诱导的

KLF2和KLF4也与HMG-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物）的多效性作用有关。有趣的是，他汀类药物西立伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀不仅诱导了 KLF2 和 KLF4 的表达，还诱导了 HUVEC 和 HAoEC 中MANTIS的表达（图4 A）。他汀类药物还增加了MANTIS的启动子活性（图4 B）。此外，siRNA介导的KLF2或KLF4的敲低降低了他汀类药物诱导的MANTIS表达。肌细胞增强因子-2a（MEF2A），KLFs上游的一个因子，的下调也产生了类似的MANTIS表达降低（图4 C）。

他汀类药物是抑制细胞内甲羟戊酸途径的限速酶。因此实验确定了该途径中的哪个中间体参与了MANTIS表达控制。添加法尼基焦磷酸（FPP）或香叶基香叶基焦磷酸盐（GGPP） 可防止阿托伐他汀介导的MANTIS诱导 （图4 D）。因此，在没有他汀类药物的情况下，香叶基香叶基转移酶I抑制剂GGTI-298也在HUVECs和HAoECs中诱导MANTIS。相反，法尼基转移酶FTase抑制剂或角鲨烯合酶抑制剂扎拉果酸AA（ZAA）效果较差（图4 E）。这些数据表明，MANTIS是由蛋白香叶基香叶基化而不是法尼基化或胆固醇本身控制的。

图4 他汀类药物在 HUVECs 和体内诱导MANTIS。

内皮细胞中的阿托伐他汀反应依赖于MANTIS

阿托伐他汀是最常用的HMG-CoA还原酶抑制剂之一，促进内皮血管生成能力。他汀类药物的这些作用是复杂的，很难与他汀类药物的主要多效性作用之一相关联：抑制小GTP酶的香叶基香叶基化。这使得人们很容易推测他汀类药物的作用是否可能部分通过诱导促血管生成的lncRNA MANTIS来实现。

MANTIS在最低浓度为100 nM阿托伐他下被诱导的。MANTIS耗竭消除了阿托伐他汀对HUVECs、HAoECs和小鼠主动脉环实验中球形生长测定的积极作用（图5 A、B），并在很大程度上减少了基质凝胶测定中阿托伐他汀刺激的内皮细胞管的数量（图5 C、D）。此外，MANTIS的敲低改变了几个阿托伐他汀调节基因的转录组学特征，如血栓调节素（THBD）（图5 E），并在划痕实验中阻止了阿托伐他汀诱导的内皮迁移效应（图5 F、G）。阿托伐他汀还可以增加端粒酶活性。ddPCR 端粒重复扩增分析法（ddTRAP）证明，MANTIS下调显著降低了基础端粒酶活性，并完全阻止了他汀类刺激下的端粒酶活性增加（图5 H、I）。这表明他汀类药物通过lncRNA MANTIS介导其积极作用。

图5 他汀类药物的多效性依赖于MANTIS。

图6 LncRNA MANTIS 介导血管保护。

研究表明，层流以及他汀类药物通过KLF2/KLF4依赖机制诱导lncRNA MANTIS。发现MANTIS介导流动和他汀类药物诱导的信号传导的几个积极方面，并发挥内皮保护作用。

总而言之，层流和他汀类药物的保护作用至少部分归因于MANTIS。因此，MANTIS可以归类为动脉粥样硬化保护性lncRNA。我们很容易推测，病变内皮细胞的两种主要保护机制，层流和他汀类药物，可能通过MANTIS调控介导其部分作用。由于MANTIS的诱导类似于他汀类药物对内皮功能的有益作用，因此提出增加MANTIS的策略可能会改善对他汀类药物治疗无反应的患者的血管功能。

参考文献：Leisegang MS, Bibli SI, Günther S, Pflüger-Müller B, Oo JA, Höper C, Seredinski S, Yekelchyk M, Schmitz-Rixen T, Schürmann C, Hu J, Looso M, Sigala F, Boon RA, Fleming I, Brandes RP. Pleiotropic effects of laminar flow and statins depend on the Krüppel-like factor-induced lncRNA MANTIS. Eur Heart J. 2019 Aug 7;40(30):2523-2533. doi: 10.1093/eurheartj/ehz393. PMID: 31222221.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31222221/

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