转化生长因子-β1 信号上调Scx ，通过 ephrin A2 抑制张力诱导的牙周韧带细胞的成骨分化

在正畸治疗中，牙齿移动时，牙槽骨的张力侧和压力侧分别发生骨形成和骨吸收。张力在牙周韧带 (PDL) 细胞中被转导为细胞内信号，并诱导成骨细胞分化活性，从而上调骨相关基因的表达。分化的成骨细胞分泌骨外基质，如骨桥蛋白 (Opn) 和骨钙素 (Ocn)，导致在PDL附近的牙槽骨表面形成新骨。值得注意的是，虽然在正畸牙齿移动过程中，张力侧的骨形成活动受到刺激，但PDL本身并没有骨化，并维持其稳态，这表明在PDL中有负调控骨形成的因子。

Scleraxis (Scx) 是一种基本的螺旋转录因子，主要在肌腱中表达，被认为对肌腱发育至关重要。在小鼠实验性牙齿移动模型中，机械应力加载后 2 天后，PDL 张力侧的 Scx 表达上调。此外，在培养的 PDL 细胞中的 Scx 过表达在成骨条件下下调 Opn 和 Ocn 的表达和矿化，而对 Osx 的表达没有显著影响。这些结果首次表明，Scx 通过抵消 Osx 的成骨活性来抑制钙化细胞外基质的形成，从而在张力侧对 PDL 的骨化具有抑制作用。然而，在受到张力的PDL 中 Scx 调节的骨化抑制的分子生物学机制尚不完全清楚。

基于此，来自日本京都大学、广岛大学、鹤见大学等高校的专家学者进行了合作研究，目的是阐明Scx在张力诱导的PDL细胞成骨分化中的抑制作用及其潜在机制。相关研究成果发表在 Bone 题为《Scleraxis upregulated by transforming growth factor-β1 signaling inhibits tension-induced osteoblast differentiation of priodontal ligament cells via ephrin A2》。

实验结果

1.在实验性牙齿移动模型中，Scx 的表达在 PDL 对张力的早期响应期间增加

使用细胞拉伸系统产生12% 的拉力加载到PDL细胞上3或6小时，在对照组中，PDL细胞在不施加拉力的拉伸室中培养。

组织学分析表明，在机械应力加载后 6 小时，PDL 间隙变宽，张力侧成纤维细胞伸长。在压力侧，PDL空间变窄，细胞在实验期间被压缩。

然后实验分析 Scx在PDL对机械应力早期反应中的表达。之前的报告表明 Scx 在整个 PDL 中广泛表达。因此，为了量化 Scx 表达的增加，评估了Scx^high 与 Scx⁺ 细胞的比例。在张力侧，与对照组相比，牙齿移动（TM）组的比例在3和6小时显著增加。在压力侧，TM组在3、6 h时比例下降，6 h时，对照组和TM组之间有显著差异 。

2.在体外加载张力的 PDL 细胞中，敲低Scx 上调碱性磷酸酶 (ALP) 的表达

实验建立了人PDL细胞体外牵张力加载实验系统。PDL细胞中Scx表达在拉力加载后3和6 h显著增加。通过在 PDL 细胞中转染靶向 Scx 的siRNA来敲低Scx，然后加载张力，分析张力诱导的 Scx 在PDL 细胞成骨分化中的作用。

在对照siRNA转染组中，张力显著上调Scx表达。在张力负荷下，Scx siRNA转染组Scx表达显著低于对照siRNA转染组，其表达水平与未加载的对照 siRNA 转染组中的表达水平相当。

为了评估在Scx敲低和不敲低情况下，张力负载的 PDL 细胞的成骨细胞分化，实验分析了 ALP 的表达，ALP 被称为早期成骨细胞分化的标志物。在对照siRNA转染组中，张力显著诱导ALP表达。在张力负荷下，Scx siRNA转染组中ALP的表达水平显著高于对照siRNA转染组。

3.张力激活的 TGF-β1-Smad3 信号通路上调 PDL 细胞中的 Scx 表达

接下来检测了 TGF-β1 信号是否影响 PDL 中的 Scx 表达以响应张力。与 PDL 张力侧的 0 和1h 相比，TGF-β1 表达在 3 和 6 h被激活。在压力侧TGF-β1 表达没有显著变化。

此外，定量分析实验牙齿移动中 PDL 早期反应期间 p-Smad3 的表达。在PDL的张力侧，与对照组相比，TM组中p-Smad3⁺ 细胞与Scx⁺ 细胞的比例在3和6小时显著增加。在 PDL 的压力侧，TM 组中的比例在实验期间没有明显变化。

这些数据表明，在 PDL 对张力的早期反应期间，张力激活了 TGF-β1-Smad3 信号通路。

下面进一步分析了由张力激活的 TGF-β1-Smad3 信号在体外刺激PDL细胞Scx表达。PDL细胞中TGF-β1、p-Smad3表达在张力加载后3 h显著上调。然后检测了TGF-β 受体抑制剂 SB-431542 、Smad3特异性抑制剂SIS3对张力诱导的PDL细胞Scx表达的影响。5 μM SB-431542 和50 μM SIS3 处理显著抑制了PDL 细胞中张力诱导的Scx表达。

4.Scx 上调 Efna2 ，在张力负荷下负调控 PDL 中 ALP 的表达

实验研究了 Efna2 是否与 Scx 调节的对 PDL 细胞张力诱导的成骨细胞分化的抑制有关。敲低Efna2 检查了张力诱导的 Efna2 对 PDL 细胞成骨分化的影响。Efna2敲低抑制了PDL细胞中张力诱导的Efna2表达。在对照siRNA转染组中，张力显著上调ALP表达。在张力负荷下，与对照 siRNA 转染组相比，Efna2 siRNA 转染组的 PDL 细胞中 ALP 的表达显著增加。

此外，在 PDL 细胞中敲低 Scx，然后加载张力，以分析 Scx 在张力诱导的 Efna2 表达中的作用。张力诱导了对照siRNA转染组Efna2的表达，而Scx siRNA转染组的Efna2在张力加载下显著低于对照siRNA转染组，且与未加载组相当。

实验结论

综上所述，该研究揭示了Scx在PDL细胞对张力的早期反应中表达上调。张力诱导的 Scx 抑制PDL 细胞的成骨分化。此外，TGF-β1-Smad3 信号通路和 Efna2 分别是 Scx 的上游和下游调控因子，以响应 PDL 细胞对张力的反应。研究结果表明，TGF-β1-Scx-Efna2 轴是一种新的分子机制，可负向调控张力诱导的 PDL 细胞成骨分化。这种机制可能有助于在生理和正畸牙齿移动过程中抑制 PDL 的骨化和维持 PDL的稳态。

参考文献：Kawatsu M, Takeshita N, Takimoto A, Yoshimoto Y, Seiryu M, Ito A, Kimura S, Kawamoto T, Hiraki Y, Shukunami C, Takano-Yamamoto T. Scleraxis upregulated by transforming growth factor-β1 signaling inhibits tension-induced osteoblast differentiation of priodontal ligament cells via ephrin A2. Bone. 2021 Aug;149:115969. doi: 10.1016/j.bone.2021.115969. Epub 2021 Apr 21. PMID: 33892176.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33892176/

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