受压缩负荷诱导的脊索细胞释放的外泌体通过 miR-140-5p/Wnt/β-Catenin 轴抑制血管生成

椎间盘（IVD）退变（IDD）和相关疾病是导致腰痛的重要原因，研究表明，IDD 的病因是多因素的。椎间盘是人体最大的无血管组织，由内髓核（NP）、周围的纤维环（AF）和相邻的软骨终板组成。健康椎间盘的特点是 AF 外表面的血管有限。然而，健康椎间盘如何抑制血管形成的机制仍不清楚。

在胚胎发生期间，杆状脊索从椎体中被截留，并在胎儿早期很快发育成 NP 组织，而血管则从内部区域退去。因此，大的、空泡化的脊索细胞（NCs）保留在 NP 组织中。越来越多的证据表明，NCs 在椎间盘发育和功能中发挥着重要作用。特别是，NCs 不仅可以激活 NP 细胞（NPs）和间充质干细胞（MSCs），而且还可以抑制血管向内生长。因此，NCs 由于其治疗潜力而受到了相当大的关注。然而，椎间盘中 NCs 的抗血管生成作用仍不清楚。

外泌体（Exosomes）是直径范围为 30-150 nm 的细胞外囊泡，由多种细胞类型分泌，包括干细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和软骨细胞。已经表明，外泌体在肿瘤转移、免疫调节、骨关节炎和血管生成中发挥重要作用。然而，没有研究表明 NCs 是否产生外泌体及其对椎间盘稳态的影响。

在第四军医大学西京医院骨科及放射科、中国人民解放军空军第986医院骨外科、军事口腔医学国家重点实验室的一项联合研究中，假设 NCs 可以分泌 NC 衍生的外泌体（NC-exos），考虑到 NCs 和生物力学的密切关系，NC-exos 可能会受到压缩载荷的影响。此外，NC-exos 可能通过向血管内皮细胞递送生物活性物质，在抑制椎间盘血管生成中发挥重要作用。对这些影响的分析可能有助于阐明 NCs 在 IDD 治疗中的应用机制。

已经表明，NCs 对具有各种影响的机械应力作出反应。因此，实验首先检测了压缩负荷对 NC-exos 的影响。在不同的压缩负荷（0 MPa、0.5 MPa、1.0 MPa）下培养 NCs，提取和分析 NC-exos。NCs 在压缩负荷培养后表现出更高的 NC-exos 浓度（图1 J）。然而，在压缩负荷培养后，细胞活力没有观察到显著差异（图1 k）。

图1 NC 衍生的外泌体（NC-Exos）对压缩载荷的响应。

为了评估 NC-exos 对血管生成的影响，来自不同压缩负荷培养物的 NC-exos 用于内皮细胞中的血管生成检测。与其他组相比，用 0.5 MPa/NC-exos 处理显著抑制了 HUVECs 的迁移（图2 A、C）。此外，0.5 MPa/NC-exos 对 HUVECs 迁移表现出剂量依赖性抑制作用（图2 B、D）。而且，0.5 MPa/NC-exos 在管形成试验中显示出抑制血管生成作用（图2 E-H)。此外，细胞增殖被 0.5 MPa/NC-exos 抑制（图2 I-L）。这些数据表明，由 0.5-MPa 压缩负荷诱导的 NC-exos 抑制内皮细胞血管生成。

图2 0.5 MPa/NC-Exos 抑制血管生成。

为了探索 0.5-MPa/NC-exos 在抗血管生成作用中的有效成分，采用 PROse K（蛋白酶 K）或 RNase A 的预处理来排除蛋白质或 RNAs 的影响。结果表明，RNase A 预处理的 0.5 MPa/NC-exos 对内皮细胞迁移、血管生成和增殖表现出减弱的抑制作用，而 PROse K 预处理与未处理组相比没有显著影响（图3 A-C），表明 RNAs 在 0.5 MPa/NC-exos 的抗血管生成作用中起重要作用。

研究表明，外泌体是有效的载体，可将 microRNAs（miRNAs）从细胞转移到细胞。因此，假设 miRNAs 通过 NC-exos 从 NCs 转移到内皮细胞。为了在 0.5 MPa/NC-exos 中识别潜在的抗血管生成相关 miRNAs，在有或没有 0.5 MPa 培养的情况下使用 NC-exos 进行 miRNA 阵列。在不同表达的 miRNAs 中，有 10 个 miRNAs（miR-140-5p、miR-182、miR-183-5p、miR-205、miR-211-3p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-361-5p、miR-434-3p、miR-541-5p）显著上调。热图表示 miRNAs 的双向层次聚类的结果（图3 D）。火山图显示 10 个上调和 5 个下调的 miRNAs（图3 E）。

为了评估上调的 miRNAs 对血管生成的影响，miRNAs 分别在 HUVECs 中过表达。在这些 miRNAs 中，miR-140-5p的上调对内皮细胞的血管生成有显著的抑制作用。证实了 miR-140-5p 在 0.5 MPa/NC-exos 中的表达（图3 F）。

然后，用 Cy3 标记的 miR-140-5p 模拟物转染 NCs 并在压缩负荷下培养，用 PKH67 标记 NC-exos 并与 HUVECs 一起孵育。HUVECs 在 0.5-MPa/NC-exos 组中显示 Cy3 和 PKH67 荧光阳性，而 HUVECs 在 0 MPa 和 1.0 MPa 组中仅显示 PKH67 荧光（图3 G）。

然后，检测 HUVECs 中 miR-140-5p 的表达，RT-PCR 结果显示，HUVECs 与 0.5 MPa/NC-exos 孵育后 miR-140-5p 水平升高，而其他组中未检测到上调（图3 H）。随着外泌体内化抑制剂 Annexin V 的应用，0.5 MPa/NC-exos 失去了上调 HUVECs 中 miR-140-5p 表达的能力（图3 I）。

这些结果表明，miR-140-5p 是 0.5 MPa/NC-exos 中抗血管生成作用的主要贡献者。

图3 miR-140-5p 通过 0.5 MPa/NC-Exos 转移至内皮细胞并抑制血管生成

为了评估 miR-140-5p 如何调节抗血管生成机制，使用了三种 mRNA 靶标预测算法（miRDB、miRWalk 和 TargetScan）来识别 miR-140-5p 的潜在下游靶标。在潜在目标中，Wnt11 在所有数据库中都有重叠（图4 A）。为了检测 Wnt11 是否是 miR-140-5p 的靶点，将 Wnt11 的 3' UTR 克隆到 HEK293A 和 HUVECs 中的荧光素酶质粒 psiCHEK-2 中。值得注意的是，Wnt11 的 3' UTR 的荧光素酶活性被 miR-140-5p 抑制（图4 B）。

然后检测了 Wnt/β-catenin 在 HUVECs 核和质中的表达。结果表明，HUVECs 中 miR-140-5p 的过表达下调 Wnt11 表达并抑制 β-catenin 核积累，而 Wnt11 表达的恢复消除了这些影响（图4 C）。

此外还检查了 HUVEC 培养物中基质金属蛋白酶（MMPs）的水平，因为它们与 Wnt/β-catenin 调控密切相关。在 miR-140-5p 过表达的 HUVEC 培养物中，MMP-2 和 MMP-7 的水平下调，而恢复 Wnt11 恢复了它们的表达（图4 D）。此外，miR-140-5p 的过表达抑制 HUVEC 迁移、块茎形成和增殖，而 Wnt11 的恢复消除了 miR-140-5p 诱导的血管生成抑制（图4 E-J）。

图4 miR-140-5p 通过其功能靶标 Wnt11 调控抗血管生成。

为了探索 0.5 MPa/NC-exos 对内皮细胞的影响，检测了 0.5 MPa/NC-exos 是否会沉默 Wnt11，从而抑制 HUVECs 的血管生成。0.5 MPa/NC-exos降低了 Wnt11 3' UTR 的荧光素酶活性，而 0 MPa/NC-exos 或 1.0 MPa/NC-exos则不能。此外，添加 miR-140-5p 抑制剂或外泌体内化抑制剂 Annexin V 显示，Wnt11 3' UTR 的荧光素酶活性恢复，表明 HUVECs 中的 Wnt11 可以被源自 0.5 MPa/NC-exos 的 miR-140-5p 沉默（图5 A）。

然后，在 0.5 Mpa/NC-exos 培养的 HUVECs 中检测 Wnt/β-catenin 的表达。0.5 MPa/NC-exos 显著降低 Wnt11 的表达并抑制 β-catenin 核积累（图6 B）。Annexin V 或 miR-140-5p 抑制剂的应用消除了这些影响。同样，恢复的 Wnt11 表达挽救了 β-catenin 核积累（图5 B、C）。此外，MMP-2 和 MMP-7 的水平在 0.5 MPa/NC-exo 处理的 HUVEC 培养物中下调，而添加 Annexin V、miR-140-5p 抑制剂或恢复的 Wnt11 增加了它们的水平（图5 D）。体外迁移试验、管形成试验和增殖试验表明，0.5 MPa/NC-exos 的处理抑制了血管生成，而 miR-25-3p 抑制剂或Annexin V 缓解其促进血管生成的功能。此外，受体细胞中 Wnt11 的恢复抑制了这些影响（图5 E-H）。这些结果表明，0.5 MPa/NC-exos 足以通过转移 miR-140-5p 并靶向 Wnt/β-catenin 通路来抑制血管生成。

图5 0.5 MPa/NC-Exos 沉默 Wnt11 并抑制 HUVECs 中的血管生成。

图6 NP的外泌体miR-140-5p表达与椎间盘血管生成呈负相关。

为了确定 NP 组织中外泌体 miR-140-5p 的水平是否与椎间盘血管生成相关，检查了来自 IDD 患者或特发性脊柱侧凸的 NP 组织。免疫荧光染色显示，IDD 的血管生成表达高于特发性脊柱侧凸（图6 A），而在特发性脊柱侧凸患者的 H&E 染色的 NP 组织中观察到更多的 NC 样细胞（图6 B）。然后，从 NP 组织培养基中分离出外泌体，并检测外泌体 miR-140-5p 的表达（图6 C）。RT-PCR 分析显示，来自 NP 组织来源的外泌体的 miR-140-3p 在 IDD 患者中下调（图6 D）。统计分析显示，miR-140-5p 水平与血管生成水平呈负相关（图6 E），表明 NP 组织中 miR-25-3p 的下调可能导致血管生成升高。这些数据表明，来自 NP 外泌体的 miR-140-5p 表达降低与椎间盘血管生成有关。

最终在 IDD 动物模型中确定了 0.5 MPa/NC-exos 对椎间盘血管形成的影响。0.5 MPa/NC-exos 在椎间盘 NP 组织中的应用显示 CD34 表达降低，表明其在体内具有抗血管生成作用（图7 A、B）。此外，通过微型计算机断层扫描评估获得的椎间盘高度指数（DHI）评估椎间盘退变程度。对照组DHI保持不变，而IDD组术后DHI持续下降（图7 C、D）。在第 6 周，与 IDD 组相比，0.5 MPa/NC-exos 的治疗显著增加了 DHI。这些结果表明，0.5 MPa/NC-exos 对退变椎间盘具有治疗作用，具有体内抗血管生成作用。

图7 0.5 MPa/NC-Exos 减少退变椎间盘组织的血管化。

图8 0.5 MPa / NC-exos通过miR-140-5p / Wnt/β-catenin轴抑制血管生成的示意图

总之，该研究结果表明，0.5 MPa/NC-exos 通过调控血管上皮细胞中的 miR-140-5p/Wnt/β-catenin 轴来抑制血管生成，为了解 NCs 的抗血管生成机制提供了见解。因此，目前的研究增加了我们对 NCs 治疗 IDD 的潜力的理解。

参考文献：Sun Z, Liu B, Liu ZH, Song W, Wang D, Chen BY, Fan J, Xu Z, Geng D, Luo ZJ. Notochordal-Cell-Derived Exosomes Induced by Compressive Load Inhibit Angiogenesis via the miR-140-5p/Wnt/β-Catenin Axis. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Oct 22;22:1092-1106. doi: 10.1016/j.omtn.2020.10.021. PMID: 33294295; PMCID: PMC7691158.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33294295/

图片来源：所有图片均来源于参考文献

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。

微信搜索公众号“Naturethink”，学习更多细胞压缩应力技术及应用！