机械超负荷诱导的miR-325-3p降低促进软骨细胞衰老，加剧小关节退变

腰痛（LBP）影响健康的常见疾病之一，终生患病率接近80%。小关节退变（Facet joint degeneration）约占慢性LBP的30%。脊柱小关节即关节突关节，位于脊柱的两侧，由上关节突和下关节突组成。生物力学结构的改变和合成代谢的紊乱最终导致小关节退变，其特征是软骨变薄、软骨下骨硬化和关节间隙变窄。近年来，双足站立模型已被公认为研究小关节退变的理想工具。小鼠站立10周后，小关节出现明显退变，国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分等级和基质金属蛋白酶13（MMP13）升高，而胶原蛋白II降低。

细胞衰老是一种以细胞周期停滞为特征的稳定状态。衰老细胞高度表达P53、P21、P16和衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），可以释放衰老相关的分泌表型（SASP），包括炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶，以影响周围细胞。在关节退变中，衰老细胞的存在加剧了关节软骨的破坏，而抑制细胞衰老可改善软骨细胞稳态并缓解骨关节炎进展。据报道，在膝关节骨关节炎中，机械超负荷可下调F-box和WD重复结构域7（FBXW7）泛素连接酶的表达并激活JNK通路，从而促进软骨细胞衰老。另一项研究报道，机械超负荷诱导的骨关节炎伴有软骨细胞衰老，而尿石素A可通过恢复线粒体稳态来减少软骨细胞衰老，从而缓解骨关节炎的进展。然而，机械超负荷是否引起腰椎小关节软骨细胞衰老以及具体机制如何尚未报道。

MicroRNAs是一系列长度为21-23nt的非编码RNA，通过沉默或降解mRNA分子调控基因表达。MicroRNAs广泛参与软骨细胞稳态和骨关节炎。小关节退变伴有microRNA表达的改变。使用反义寡核苷酸抑制miR-181a-5p可减轻小关节软骨退变的严重程度。包括microRNAs在内的非编码RNAs在软骨细胞衰老中起重要作用。据报道，MiR-29b-5p可缓解软骨细胞衰老，p21和p16表达降低。然而，机械超负荷是否通过microRNAs调节软骨细胞衰老仍然未知。

在湖南省中南大学湘雅医院脊柱外科、器官损伤衰老与再生医学湖南省重点实验室等研究团队一项研究中，证明了机械超负荷诱导的miR-325-3p降低可以通过增加trp53表达来促进软骨细胞衰老。利用AAV上调miR-325-3p表达可有效减轻软骨细胞衰老，缓解小关节退变的进展，为小关节退变提供潜在的治疗方法。

人和小鼠小关节退变伴有软骨细胞衰老

实验首先探究了退变对软骨衰老的影响。从患者手术中获得小关节软骨，HE染色显示，退变的FJ软骨变薄，胶原蛋白成分减少（图1 A）。 Safranin O还表明，退变FJs的软骨细胞大大减少（图1 B）。与正常关节相比，退变关节的OARSI评分升高（图1 C）。与正常组织相比，退变FJ的P53阳性或P21阳性软骨细胞增加（图1 D-G）。

然后进一步研究了小鼠退变FJ中是否也存在细胞衰老，使用双足站立模型诱导小鼠FJ退变，这显著增加了脊柱轴向应力。结果发现，小鼠两侧的小关节退变没有显著差异。与对照组相比，站立10周后，关节软骨变薄，软骨细胞减少，OARSI评分升高（图1 H-J）。免疫组化（IHC）染色还表明，站立10周后，小鼠P53和P21阳性细胞明显增加（图1 K-N）。这些结果表明，FJ退变表现出骨关节炎的特征，伴有软骨细胞衰老。

图1 软骨细胞衰老与人类和小鼠的腰椎小关节（FJ）退变有关。

体外机械超负荷诱导的软骨细胞衰老和SASP释放

为了探索体外机械负荷是否会影响软骨细胞衰老，分离了原代软骨细胞，在0.5 Hz的频率下，用5%和20%的拉伸应力加载0h、6h、12h和24h。在5%的拉伸应力下，处理6 h后胶原蛋白II含量差异不显著，12h和24h后其含量增加。在20%的拉伸应力下，胶原蛋白II含量逐渐降低（图2 A、B）。Col2a1的qRT-PCR显示出类似的趋势（图2 C）。在5%的拉伸应力下，MMP13表达逐渐降低，而在20%拉伸应力下呈时间依赖性逐渐升高（图2 D）。

然后进一步对SA-β-gal和P21 进行染色，以评估机械应力对软骨细胞衰老的影响。在5%拉伸应力下，SA-β-gal阳性细胞的比例无统计学差异。在20%拉伸应力下，SA-β-gal阳性细胞的数量随刺激时间的延长而增加（图2 E、G）。P21（红色）的免疫荧光染色显示出类似的趋势（图2 F、H）。qRT-PCR结果显示，在20% 拉伸应力作用24h后，PAI-1、IL-6和TGF-β等SASP因子显著升高（图2 I）。这些结果表明，适当的机械应力有利于软骨细胞的合成代谢，并且不会导致软骨细胞衰老。然而，过度的机械应力不利于细胞合成代谢并导致软骨细胞衰老。

图2 体外过度的机械负荷诱导软骨细胞衰老。

过度机械应力下软骨细胞中MiR-325-3p下调

为了探索机械超负荷诱导的软骨细胞衰老的机制，通过筛选关节退变和骨关节炎相关的microRNAs进行了microRNA阵列分析。结果显示，在这些microRNAs中，miR-325-3p的降低最为显著。接下来检测了小鼠腰椎小关节中的miR-325-3p表达。结果显示，miR-325-3p主要在软骨层表达，与对照组相比，站立10周后明显下调。这些结果表明，机械过载降低了miR-325-3p在体内和体外的表达。

体外MiR-325-3p过表达挽救机械超负荷诱导的软骨细胞衰老

为了研究miR-325-3p在机械超负荷诱导的软骨细胞衰老中的作用，构建了miR-325-3p模拟物和抑制剂。在没有拉伸应力下，miR-325-3p抑制剂降低了胶原蛋白II的表达，衰老软骨细胞（SA-β-gal和P21阳性细胞）的数量增加，衰老相关基因P21、P16、P53和SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β上调。

然后，在20%的拉伸应力下施用miR-325-3p模拟物，以确认miR-325-3p对软骨细胞衰老的影响。在机械过载下，miR-325-3p模拟物显著增加胶原II表达。在20%拉伸应力处理24h后，miR-325-3p模拟物可以减少衰老软骨细胞（SA-β-gal阳性细胞和p21阳性细胞）的数量，明显降低了衰老相关基因P21、P16、P53和SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β的表达。这些结果表明，miR-325-3p可以挽救机械超负荷诱导的软骨细胞损伤和衰老。

小鼠双足站立模型中表达AAV的miR-325-3p减轻机械超负荷诱导的软骨细胞衰老和FJ退变

为了探究miR-325-3p对体内软骨细胞衰老和FJ退变的影响，构建了表达miR-325-3p的腺相关病毒（AAV）。AAV-miR-325-3p促进了软骨细胞中miR-325-3p的表达（图3 A、B）。HE和safranin O染色表明，AAV-miR-325-3p增加了软骨厚度和软骨细胞数量（图3 C）。在给予AAV-miR-325-3p后，OARSI评分也升高（图3 D）。

为了评估AAV-miR-325-3p对软骨细胞衰老的影响，进行了p53和p21的IHC。与对照组相比，接受AAV-NC的实验小鼠p53和p21阳性细胞数量增加，而关节内注射AAV-miR-325-3p时衰老软骨细胞减少（图3 E-H）。IHC染色显示，AAV-miR-13-325p处理后，胶原蛋白II阳性和蛋白聚糖阳性软骨细胞数量明显升高，而MMP 13阳性细胞减少。这些结果表明，表达miR-325-3p的AAV可以有效延缓软骨细胞衰老，减轻机械超负荷引起的FJ退变。

图3 AAV-miR-325-3p OE（过表达）缓解站立模型小鼠腰椎小关节软骨衰老。

MiR-325-3p 通过靶向 trp53 减轻软骨细胞衰老

实验最后进一步探讨了miR-325-3p调控软骨细胞衰老的机制。通过预测miR-325-3p的下游靶基因和与衰老相关的GO通路相交，发现了5个潜在基因（Trp53，TBX，SRF，Trp63，P21）（图4 A）。随后，通过qRT-PCR发现，用miR-325-3p模拟物处理后，软骨细胞中Trp53和P21表达明显降低，而TBX、SRF和Trp63的表达没有差异（图4 B）。然后验证了miR-325-3p和Trp53之间的结合关系。Trp53的3′UTR具有与miR-325-3p互补的序列（图4 C）。双荧光素酶报告基因测定的结果表明，当用野生型Trp53质粒转染293个T细胞时，miR-325-3p模拟物降低了荧光素酶活性。当273个T细胞用突变体Trp53质粒转染时，未观察到任何变化，表明miR-325-3p可以直接靶向Trp53（图4 D）。

为了进一步探讨miR-325-3p是否通过调控Trp53抑制软骨细胞衰老，使用了浓度为0.5 μM的p53激活剂NSC-207895。首先探讨了miR-325-3p模拟物处理后NSC-207895对机械应力下软骨细胞的影响。结果发现，NSC-207895可以逆转miR-325-3p在机械过载下对软骨细胞的促进合成代谢作用。然后，SA-β-gal染色和P21（红色）染色显示，miR-325-3p减轻机械过载诱导的软骨细胞衰老，SA-β-gal阳性细胞和p21阳性细胞减少，但当用NSC-207895处理时，这种效果减弱（图4 E-G）。此外，NSC-207895在mRNA和蛋白质水平上分别降低了miR-325-3p模拟物下调P16、P21和P53表达的作用（图4 H-J）。同时，miR-325-3p降低了SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β的表达，然而，NSC-207895 减弱了这种效果（图4 H）。这些结果表明，miR-325-3p通过抑制Trp53表达来减轻软骨细胞衰老和SASP释放。

图4 靶向P53的miR-325-3p和NSC-207895 在体外逆转miR-325-3p抑制机械应力诱导的细胞衰老的作用。

总之，该研究表明，miR-325-3p通过激活p53/p21通路来减少软骨细胞衰老并减轻机械过载诱导的脊柱小关节退变，这可能为延缓脊柱小关节退变进展提供潜在的治疗策略。

参考文献：Zhao J, Li C, Qin T, Jin Y, He R, Sun Y, Liu Z, Wu T, Duan C, Cao Y, Hu J. Mechanical overloading-induced miR-325-3p reduction promoted chondrocyte senescence and exacerbated facet joint degeneration. Arthritis Res Ther. 2023 Apr 4;25(1):54. doi: 10.1186/s13075-023-03037-3. PMID: 37016437; PMCID: PMC10071751.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37016437/

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