宫颈癌体外模型中CCL22极化TAMs 到 M2a巨噬细胞

宫颈癌是全球女性癌症死亡的第四大原因，也是第三大常见癌症。目前，免疫疗法是宫颈癌治疗的突破性进展。然而，总缓解率较低。因此，进一步确定新的免疫检查点的努力至关重要。

根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞和M2型即替代性活化的巨噬细胞。最近，研究描述了M2巨噬细胞的三种不同亚型（M2a，M2b和M2c）。M2a巨噬细胞被IL-4极化，在组织重塑和减轻炎症中起作用。M2亚型在肿瘤中起作用，M2a协同促进迁移性和侵袭性乳腺癌细胞反应。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），包括M1和M2型巨噬细胞，靶向TAMs，能够有效抑制肿瘤的生长和转移，因此，TAMs 是具有潜力的抗肿瘤靶标。TAMs可以通过直接参与T细胞抑制和凋亡受体来抑制T细胞功能。然而，一些研究表明，TAMs的Fc γ受体参与抗体依赖性细胞毒性。因此，TAMs的清除会阻断效应T细胞的反应，导致药物作用降低。将促肿瘤的TAMs调控为抗肿瘤类型是研究的重要焦点。

C-C基序趋化因子配体22（CCL22）作为一种分泌蛋白，参与各种免疫细胞的趋化活性，包括单核细胞和活化的T淋巴细胞。CCL22已被证明在肿瘤促进中起作用。M2巨噬细胞中表达的大量CCL22使结直肠癌对化疗具有耐药性。此外，CCL22的mRNA在宫颈癌组织中的表达高于正常宫颈组织中的mRNA。已经证明，CCL22与宫颈癌预后相关。然而，CCL22促进宫颈癌进展的机制尚不清楚。

在德国慕尼黑大学附属医院妇产科、心脏病科、病理科以及奥格斯堡大学附属医院妇产科的一项联合研究中，构建了体外共培养体系以形成TAMs，通过流式细胞术评估了CCL22对M2a标志物CD206表达的影响，并揭示了CCL22可能是宫颈癌的治疗靶点，这可能是由于其在调节巨噬细胞极化中的作用。

CCL22在宫颈癌体外TAMs中的表达

为了确定体外宫颈癌中CCL22 mRNA水平，实验量化了其在TAMs，M1，M2a，M2b和M2c巨噬细胞中的表达。为了获得TAMs，将宫颈癌细胞与M0巨噬细胞共培养48小时。结果表明，与HeLa或Siha细胞（人宫颈癌细胞）共培养的TAMs中CCL22的mRNA水平显著高于M1巨噬细胞。应该注意的是，虽然无显著性差异，但CCL22的mRNA水平在TAMs中表现出高于M2b和M2c巨噬细胞的趋势，而在M2a巨噬细胞中较低。此外，单独培养或与M0巨噬细胞共培养的宫颈癌细胞系中CCL22的mRNA水平极低（图1）。这些结果表明，CCL22主要来源于宫颈癌微环境中的TAMs，而非宫颈癌细胞。

图1 CCL22在宫颈癌体外TAMs中的表达。由极化的巨噬细胞（M1、M2a、M2b、M2c）、TAMs（肿瘤相关巨噬细胞，由与HeLa或Siha细胞共培养形成）、宫颈癌细胞HeLa、Siha、co-HeLa 和co-Siha（单独和在共培养系统中）制备总RNA。使用CCL22特异性引物构建RT-PCR分析。

CD206++ 和 CD163++ 分别是 M2a 和 M2c 巨噬细胞的标志物

不同亚群的巨噬细胞中的表面分子不同，包括CD80，CD86，CD206，LIGHT（TNFSF14），TLR4和CD163。通过流式细胞术测试细胞表面分子的表达。将FMO样品和未极化巨噬细胞M0分子的平均荧光强度（MFI）分别视为 marker+ 和marker++ 的临界值。M1和M2b巨噬细胞的CD80++百分比明显高于其他组（图2 a、b）。M2a巨噬细胞的CD206++百分比明显高于所有其他巨噬细胞亚型（图2 c、d）。LIGHT未显示显著变化（图2 e、f）。与所有其他巨噬细胞亚型相比，M2c巨噬细胞的CD163++ 含量显著更高（图2 g、h）。综上所述，CD80++无法区分M1和M2b巨噬细胞，其中M2a巨噬细胞的标志物是CD206++，M2c巨噬细胞标志物是CD163++。

图2 CD206++和CD163++分别是M2a和M2c巨噬细胞的标志物。

CCL22 可通过自分泌通路将宫颈癌中 TAMs 极化为的 M2a 巨噬细胞

如前所述，CCL22+ 细胞浸润量较高可预测宫颈癌预后不良。正常宫颈组织局部免疫微环境中CCL22 mRNA水平低于宫颈癌组织。CCL22是M2a巨噬细胞的标志物。因此，有必要研究CCL22是否可能通过诱导M2a巨噬细胞的生成来促进肿瘤进展。为了验证这一点，实验通过转染人CCL22特异性siRNA（si-CCL22）或阴性对照siRNA（sicon-CCL22）在M0细胞中进行RNA干扰。随后，分别将处理后的M0细胞与HeLa和Siha细胞共培养。实时PCR分析证实了RNA干扰的效率（图3 a）。si-CCL22 TAMs中 CCL22 mRNA的表达量为sicon-CCL22的17%。

从共培养的细胞中分离出共培养的sicon-CCL22 TAMs和共培养的si-CCL22 TAMs。接下来，通过流式细胞术检测了siCCL22-TAMs与sicon-TAMs 的CD206的表达。如图3 b-e，敲低CCL22表达显著降低了与HeLa细胞和Siha细胞共培养的TAMs的CD206的MFI。这些数据表明，敲低CCL22可以阻止M2a巨噬细胞的极化。

CCL22载体的效率通过实时荧光定量PCR分析（图3 f）。从共培养的细胞中分离出T-CCL22 TAMs中CCL22 mRNA的表达。接下来，通过流式细胞术检测了T-CCL22-TAMs与con-TAMs 的CD206的表达。如图3 G-J ，过表达的CCL22分别大大提高了与HeLa和Siha细胞共培养的TAMs中的CD206的MFI。这些数据表明，过表达的CCL22阻止了M2a巨噬细胞的极化。

图3 CCL22可以通过自分泌通路使宫颈癌中的TAMs极化为M2a巨噬细胞。

这项研究表明，CCL22是从TAMs而不是宫颈癌细胞系分泌的。而且，在宫颈癌中，当巨噬细胞在含有人血清的培养基中培养时，CD206++ 是M2a巨噬细胞的标志物，CD163++是M2c巨噬细胞的标志物，CD80++ 是M1和M2b巨噬细胞的标志物。CCL22可以使宫颈癌中TAMs向M2a巨噬细胞极化。因此，CCL22可能是其治疗的治疗靶点。

参考文献：Wang Q, Sudan K, Schmoeckel E, Kost BP, Kuhn C, Vattai A, Vilsmaier T, Mahner S, Jeschke U, Heidegger HH. CCL22-Polarized TAMs to M2a Macrophages in Cervical Cancer In Vitro Model. Cells. 2022 Jun 25;11(13):2027. doi: 10.3390/cells11132027. PMID: 35805111; PMCID: PMC9265611.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35805111/

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