甘草查耳酮A 抑制肺癌细胞中干扰素-γ 诱导的程序性死亡配体 1

近年来，针对程序性死亡配体1（PD-L1）和程序性死亡受体1（PD-1）的抗体免疫疗法在肺癌治疗中取得了很大进展。PD-1 可以与其配体 PD-L1 相互作用，在肿瘤微环境中负调控 T 细胞相关的免疫反应，导致肿瘤细胞逃避 T 细胞介导的免疫监视。先前的研究结果表明，具有抑制 PD-L1 能力的小分子可能是增强抗肿瘤免疫的关键方法。

PD-L1 表达的调控涉及多种机制，其中 IFN-γ 诱导的 PD-L1 是多种癌症类型中 PD-L1 的主要来源。IFN-γ，主要由 CD8⁺ T 细胞和自然杀伤细胞产生，在肿瘤微环境中是一把双刃剑。IFN-γ 诱导 PD-L1 表达以抑制细胞毒性T 淋巴细胞的功能并促进多种癌症类型的肿瘤生长。因此，干扰 IFN-γ 诱导的 PD-L1 的药物可能具有应用于免疫治疗的潜力。

甘草查耳酮A （Licochalcone A ，图1 A）是一种从豆科植物甘草中提取的查耳酮类化合物。研究表明，LCA 通过增加肺癌细胞中 C/EBP 同源蛋白的表达，诱导细胞凋亡、自噬并降低细胞活力。它还通过诱导多种类型的癌细胞凋亡来发挥抗癌作用，并通过调节 PI3K/Akt 通路抑制口腔鳞癌细胞的侵袭和迁移。

以往的研究主要集中在 LCA 对肿瘤细胞的细胞毒性作用，而中药质量研究国家重点实验室（澳门大学）、中国药科大学天然药物国家重点实验室的研究团队曾旨在证明 LCA 的另一种潜在的抗癌机制，即通过下调 IFN-γ 诱导的 PD-L1 表达来逆转癌细胞的免疫逃逸。

LCA 对肺癌细胞中 IFN-γ 诱导的 PD-L1 蛋白表达的影响

首先，人肺癌 A549 细胞系用 5、10、15 和 20 μM LCA 与或不与 IFN-γ（5 ng/ml）处理 24 小时，使用蛋白质印迹法测定 PD-L1 蛋白表达。如图1 B，IFN-γ 诱导 PD-L1 多条带表达，这可能是由于 PD-L1 的糖基化。10、15 和 20 μM LCA 在 A549 细胞中抑制 IFN-γ 触发的 PD-L1 表达，而 5 μM LCA 引起 IFN-γ 诱导的 PD-L1 的条带偏移，可能是因为 5 μM LCA 部分干扰了 PD- L1 表达并进一步影响 PD-L1 糖基化。

接下来选择 10 μM LCA 进行进一步研究。用 10 μM LCA 预处理细胞 1 小时，然后用 5 ng/ml IFN-γ 处理 0.5、3、6、12、24 小时。如图1 C，10 μM LCA 在 6h-24h 内在 A549 细胞中抑制 IFN-γ 诱导的 PD-L1 表达。

为了进一步证实 LCA 对 IFN-γ 诱导的 PD-L1 表达的影响，实验研究了另外两种肺癌细胞系NCI-H1299 和 NCI-H1650。如图1 F-I ，10 μM LCA 还消除了 NCI-H1299 和 NCI-H1650 细胞中 IFN-γ 诱导的表达。这些结果表明，10 μM LCA 可抑制 IFN-γ 触发的肺癌细胞中 PD-L1 膜定位。

图1 LCA 对 IFN-γ 诱导的肺癌细胞 PD-L1 蛋白表达的影响。

LCA 对 Jurkat T 细胞在共培养系统中增殖和存活的影响

为了确定 PD-L1 表达的生理相关性，使用共培养系统评估 A549 细胞 PD-L1 水平对 Jurkat T（人急性T细胞白血病细胞 ）细胞功能的影响（图2 A ）。首先测量了共培养系统中 Jurkat T 细胞的增殖。与对照组相比，IFN-γ（5 ng/ml）处理组的 Jurkat T 细胞增殖受到抑制，而这种增殖抑制作用在 10 μM LCA 存在时恢复，1 μM RUXO 处理则部分逆转（图2 B、C）。

接下来，在共培养系统中分析 Jurkat T 细胞的凋亡。在图2 D、E 中，位于 Q2 和 Q3 上的细胞被认为是凋亡细胞。与对照组（2.18% ± 0.25%）相比，5 ng/ml IFN-γ 处理的 A549 细胞增加了 Jurkat T 细胞的凋亡率（17.34% ± 4.65%）。此外，在 10 μM LCA 或 1 μM RUXO 存在下，IFN-γ 处理的 A549 细胞对 Jurkat T 细胞的促凋亡作用受到抑制。结果表明，10 μM LCA 可减少共培养系统中的 Jurkat T 细胞凋亡。

图2 LCA 对 Jurkat T 细胞在共培养系统中增殖和存活的影响。（A）共培养系统的程序。（B、C）共培养 48 小时后，测量Jurkat 细胞增殖的平均荧光强度（MFI）。RUXO：鲁索替尼。（D、E）在 24 小时共培养后评估凋亡的 Jurkat 细胞。

LCA 对蛋白质合成的影响

由于 GSK3β 等多种因素介导 PD-L1蛋白降解，LCA 可能通过蛋白降解途径下调 IFN-γ 诱导的 PD-L1。如图3 B，蛋白酶体抑制剂 MG-132 和溶酶体抑制剂氯喹（CQ）均未能逆转 10 μM LCA 介导的 IFN-γ（5 ng/ml）引发的 A549 细胞中 PD-L1 表达的降低。

基于上述结果，LCA 可能通过抑制蛋白质合成来消除 IFN-γ 触发的 PD-L1 表达。在此，顺铂CIS（20 μM）和蛋白质合成抑制剂 CHX（50 μM）分别用作阴性和阳性对照（图3 C）。与 CHX 类似，用 10 μM LCA 处理可以抑制蛋白质合成。

蛋白质翻译分为两种类型，即帽依赖性翻译和非帽依赖性翻译。帽依赖性翻译是一种真核翻译，它依赖于 eIF4e 与 5' 帽的结合来启动 mRNA 翻译，而非帽依赖性翻译不需要 5' 帽，而是需要内部核糖体进入位点（IRES）来启动翻译。为了确认抑制蛋白质合成的结果，引入了海肾萤光素酶-IRES-萤火虫萤光素酶（RLUC-IRES-FLUC）质粒（图3 D）。与对照组相比，RLUC 和 FLUC 强度的倍数变化分别代表帽依赖性和非帽依赖性翻译。正如预期的那样，10 μM LCA 处理将 RLUC 强度和 FLUC 强度降低了约 40%（图3 E），表明 10 μM LCA 抑制帽依赖性和非帽依赖性翻译。

图3 LCA 对蛋白质合成的影响。

LCA 对 ROS 生成的影响

据报道，ROS 会抑制蛋白质合成。LCA 是否通过产生 ROS 来消除 IFN-γ 诱导的 PD-L1 有待进一步研究。

首先将 10 μM LCA 分别在 0.25、1、3、6、12 h 点作用于 A549 细胞，结果表明，10 μM LCA 在 A549 细胞中以时间依赖性方式诱导 ROS 生成。H2O2（处理0.25 h）为阳性对照（图4 A、B）。

然后，在 A549 细胞12 小时的时间点，将抗氧化剂 NAC（5 mM 和 10 mM）与或不与 10 μM LCA 联合预处理 1 小时，然后用 5 ng/ml IFN-γ 处理 12 小时。如图4 C、D，IFN-γ 单组对 ROS 生成无显著影响，而 10 μM LCA 和 LCA 加 IFN-γ 均显著诱导 ROS 生成。此外，5 mM 和 10 mM NAC 使 10 μM LCA 诱导的 ROS 生成的 MFI 分别降低了约 45% 和 65%。更重要的是，NAC 还部分逆转了 A549 细胞中 12 小时点的 PD-L1 膜定位（图4 E、F）。基于上述结果，LCA 可能通过 ROS 产生消除了 IFN-γ 诱导的 PD-L1 翻译。

图4 LCA 对 ROS 生成的影响。

图5 图形概要

LCA 在人肺癌细胞中下调 IFN-γ 诱导的 PD-L1蛋白表达和膜定位，无论是否抑制 PD-L1 mRNA 水平或促进其蛋白降解。LCA 降低了共培养系统中 A549 细胞中由 IFN-γ 诱导的 PD-L1 表达引起的 Jurkat T 细胞的凋亡和增殖抑制。引人注目的是，LCA 被证实是一种蛋白质合成抑制剂，它降低了帽依赖性和非帽依赖性翻译。LCA 抑制 PD-L1 翻译，可能是由于 4EBP1 磷酸化（Ser 65）的抑制和 PERK-eIF2α 通路的激活。此外，LCA 在肺癌细胞中以时间依赖性方式诱导 ROS 生成。NAC 不仅抑制由 LCA 触发的 ROS 生成，而且还恢复了 IFN-γ 诱导的 PD-L1 表达。通过与 NAC 共处理，LCA 触发的 4EBP1 磷酸化（Ser 65）抑制和 PERK-eIF2α 轴的激活均得到恢复。

该研究首次发现 LCA 通过翻译抑制作用消除 IFN-γ 诱导的 PD-L1，为 LCA 在癌症免疫治疗中的应用提供了新的思路。LCA 对翻译过程的确切靶点以及 LCA 对抗肿瘤免疫反应的体内生物学作用有待进一步研究。

参考文献：Yuan LW, Jiang XM, Xu YL, Huang MY, Chen YC, Yu WB, Su MX, Ye ZH, Chen X, Wang Y, Lu JJ. Licochalcone A inhibits interferon-gamma-induced programmed death-ligand 1 in lung cancer cells. Phytomedicine. 2021 Jan;80:153394. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153394. Epub 2020 Oct 22. PMID: 33130472.

原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33130472/

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