层流剪切应力通过 miR-29b-3p/CX3CL1 轴调控减轻单核细胞粘附和动脉粥样硬化的发展

根据血流形态和位置的不同，流体剪切应力有不同的表现形式。例如，当血液在血管的直线部分流动时，会产生层流剪切应力（Lss），但当血液流过血管分支、分叉或弯曲时，会产生振荡剪切应力或湍流。大量研究证实，动脉粥样硬化（AS）在直血管中的发生率较低，而血管分叉处和弯曲处的动脉粥样硬化发生率较高。因此，Lss 具有重要的抗 AS 作用。

CX3CL1 是由 373 个氨基酸组成的大分子蛋白，是目前已知的 CX3C 趋化因子家族中唯一已知的成员。研究报道，低剪切应力通过激活 CX3CL1 诱导单核细胞与 TNF-α（也称为 TNF）激活的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的粘附，而生理剪切应力消除了这种内皮炎症。通过分析高通量测序数据，发现 CX3CL1 在 Lss 处理的内皮细胞中表达水平较低。因此，进一步的研究需要揭示 Lss 通过降低 CX3CL1 表达来抑制 AS 进展。

MicroRNAs（miRNAs）是一种长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA，参与转录后基因表达的调控。研究提出，Lss 通过调节 miRNAs 来维持内皮细胞功能的稳定，从而发挥抗 AS 作用。有鉴于此，需要探讨 Lss 敏感的 miR-29b-3p 对内皮细胞功能和 AS 形成的影响。

吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室、新疆医科大学基础医学院免疫学系、吉林大学第一医院心血管疾病诊治中心的联合团队的一项研究结合生物信息学、分子生物学和其他研究方法检测了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 轴，在体外和体内探讨了该轴对内皮细胞炎症和 AS 发生发展的影响，从而提高了对 AS 调控的认识，为 AS 的防治提供了新的思路和见解。

为了探索 Lss 对血管内皮细胞功能的影响，实验确定了在 Lss（12 dyn/cm²）处理的人主动脉内皮细胞（HAECs）和 HUVECs 中下调的 25 个 mRNAs 作为关键 mRNAs。

有研究报道，CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 参与 AS 的发生和发展。因此，使用定量实时 PCR（qRT-PCR）来测量静态和 Lss 处理的 HAECs 中 CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 的 mRNA 表达。鉴于CX3CL1 mRNA 表达降低最显著，于是将 CX3CL1 确定为后续研究的靶基因。与 HUVECs-static 组相比， HUVECs-Lss 组 CX3CL1 的 mRNA 表达也降低，与实验中生物合成分析结果一致。

这表明，Lss 可以降低内皮细胞中 CX3CL1 mRNA 和蛋白表达，所以 CX3CL1 是 Lss 敏感基因。

研究报道，内皮 CX3CL1 诱导单核细胞粘附，从而破坏血管内皮功能。qRT-PCR 和蛋白质印迹显示，与阴性对照组相比，TNF-α 诱导 HAECs 中 CX3CL1、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的 mRNA 和蛋白表达增加。然而，在转染 sh-CX3CL1-1 后，CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的表达受到抑制（图1 B-D）。此外，降低的 CX3CL1 表达抑制了 TNF-α 刺激的单核细胞粘附的增强（图1 E、F）。

实验进一步探讨了 Lss 是否通过调节 CX3CL1 表达影响内皮细胞功能。HAECs 转染 CX3CL1 过表达质粒（pri-CX3CL1）后，CX3CL1 的 mRNA 表达明显上调，说明 CX3CL1 过表达细胞模型成功建立（图1 G ）。

如图1 H-J 所示，Lss 显著抑制 TNF-α 刺激的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白表达的增加，上调 CX3CL1 的表达逆转了 Lss 的抑制作用。此外，对单核细胞粘附的分析表明，CX3CL1 的过表达部分逆转了 Lss 对 TNF-α 刺激的单核细胞粘附增强的抑制作用（图1 K、L）。

这表明，Lss 通过抑制 CX3CL1 表达损害单核细胞对活化 HAECs 的粘附。

图1 Lss 通过抑制 CX3CL1 的表达，损害单核细胞对活化 HAECs 的粘附。

最近的研究表明，受流体剪切应力调控的 miRNAs 是治疗心血管疾病的潜在靶点。因此，为了分析 Lss 依赖性保护内皮细胞功能的分子机制，研究检测了响应 Lss 调节 CX3CL1 表达的上游 miRNAs。

qRT-PCR 显示，与 HAECs-static 组相比，Lss 最显著上调了 miR-29b-3p 的表达。进一步验证表明，过表达 miR-29b-3p 抑制 CX3CL1 mRNA 和蛋白表达，而敲低 miR-29b-3p 则促进 CX3CL1 mRNA 和蛋白表达。

这表明，CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶点。

随后，研究探讨了 miR-29b-3p 是否在 TNF-α 激活的 HAECs 中调节 CX3CL1 的表达。qRT-PCR 和蛋白质印迹显示，miR-29b-3p 过表达显著抑制 TNF-α 诱导的 CX3CL1 mRNA 和蛋白质表达升高（图2 B-D）。此外，miR-29b-3p 过表达还显著抑制 TNF-α 诱导的 VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白质表达的增加，以及单核细胞粘附的增强（图2 E-I）。

为了进一步验证 miR-29b-3p 是否通过调节 CX3CL1 表达抑制单核细胞粘附到活化的 HAECs，将 pri-miR-29b-3p 和 pri-CX3CL1 共转染到 TNF-α 激活的 HAECs 中。如图2 J-L，在 TNF-α 激活的 HAECs 中，CX3CL1 的过表达消除了 miR-29b-3p 对 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白质表达的抑制作用。此外，miR-29b-3p 过表达显著抑制单核细胞与 TNF-α 激活的 HAECs 的粘附，而 CX3CL1 过表达逆转了这种抑制作用（图2 M、N）。

鉴于 miR-29b-3p 是 Lss 敏感的 miRNA，还探讨了在加载 Lss 的条件下，miR-29b-3p 敲低对内皮细胞粘附的影响。如图2 O-Q，在加载 Lss 后，TNF-α 上调的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白质表达受到抑制，而 miR-29b-3p 的敲低则逆转了这种抑制作用。同样，miR-29b-3p 敲低也逆转了 Lss 对单核细胞粘附到 TNF-α 激活的 HAECs 的抑制作用（图2 R、S）。

这表明，Lss 通过调控 miR-29b-3p/CX3CL1 轴损害单核细胞对活化的 HAECs 的粘附。

图2 Lss 通过调控 miR-29b-3p/CX3CL1 轴损害单核细胞与活化的 HAECs 的粘附。在存在或不存在 TNF-α（10 ng/ml）的情况下，用 pri-miR-29b-3p 或阴性对照转染 HAECs。

有研究提出，一些内皮 miRNAs 通过调节 NF-κB 信号通路来控制细胞粘附分子的转录，从而影响单核细胞与内皮细胞的粘附。为了进一步阐明 Lss 敏感 miR-29b-3p/CX3CL1 轴介导的内皮细胞粘附调节的分子机制，分析了 Lss、miR-29b-3p 和 CX3CL1 对 TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信号通路的影响。

如图3 A、B 所示，加载 Lss 后，TNF-α 诱导的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上调受到抑制。此外，Lss 显著抑制 TNF-α 诱导的 p65 和 IκBα（也称为 RELA 和 NFKBIA）磷酸化（图3 A、B），表明 Lss 可能通过抑制 NF-κB 信号通路的激活来调节内皮细胞炎症。

p65 的核转位是激活 NF-κB 信号的关键。如图3 C-E 所示，加载 Lss 后，p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 细胞核中的积累显著减少。此外，免疫荧光分析表明，Lss 显著降低了 TNF-α 诱导的 p65 核转位（图3 F）。值得注意的是，miR-29b-3p 敲低逆转了 Lss 对 TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信号通路的抑制作用。

实验还探讨了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 轴是否可以调节 TNF-α 激活的 HAECs 中的 NF-κB 信号传导。如图3 G、H 所示，miR-29b-3p 的过表达显著抑制了 TNF-α 刺激的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上调，以及 p65 和 IκBα 的磷酸化。在 CX3CL1 敲低的 TNF-α 激活的 HAECs 中获得了相同的结果。miR-29b-3p 的过表达或 CX3CL1 的敲低减少了 p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 的细胞核中的积累（图3 I-K）。此外，免疫荧光分析还显示，过表达 miR-29b-3p 或敲低 CX3CL1 显著降低了 TNF-α 诱导的 p65 核转位（图3 L）。

这表明，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 轴通过阻断 NF-κB 信号通路减轻内皮细胞炎症反应。

图3 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 轴通过阻断 HAECs 中的 NF-κB 信号通路来减轻炎症反应。

为了在体内将 Lss 与 miR-29b-3p 和 CX3CL1 联系起来，实验研究了暴露于湍流（Oss）的ApoE^-/- 小鼠主动脉弓内膜和暴露于 Lss 的胸降主动脉内膜中 miR-29b-3p 和 CX3CL1 的表达水平。结果表明，与主动脉弓相比，暴露于 Lss 的胸主动脉内膜中 miR-29b-3p 的表达上调，而 CX3CL1 的表达下调。此外，体外研究发现，经振荡剪切应力（0.5±4 dyn/cm²）处理的 HAECs 中 CX3CL1 的表达上调，而 miR-29b-3p 的表达下调。

为了确认 miR-29b-3p 是否在体内调节 AS 进展，给 6 周大的雄性ApoE^-/- 小鼠喂食正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD ）4 个月。随后检测 ApoE^-/- 小鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的浓度。结果表明，与喂食ND的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠血清中 HDL-C 浓度显著降低，而 TG、TC 和 LDL-C 浓度显著升高。然而，当 miR-29b-3p 过表达时，HDL-C、TG、TC 和 LDL-C 的浓度恢复（图4 C-F）。如图4 G，与喂食 ND 的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主动脉内膜表面不光滑。伴随着内膜增厚和较大的斑块形成，表明 AS 小鼠模型建立成功。然而，当注射 agomir-miRNA-29b-3p 时，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主动脉内膜斑块面积显著减少（图4 G ）。

这表明，miR-29b-3p 在体内改善 AS。

实验还探讨了 miR-29b-3p 是否通过控制 CX3CL1 的表达来调节 AS 小鼠的内膜炎症，从而影响 AS 的发生和发展。蛋白质印迹显示，miR-29b-3p 的过表达逆转了喂食 HFD 的ApoE^-/- 小鼠主动脉内膜中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 蛋白表达的增加（图4 J、K）。此外，免疫组化染色显示，与喂食 ND 的ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠主动脉中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表达显著增加。然而，miR-29b-3p 的过表达下调了主动脉中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表达（图4 L）。

总之，miR-29b-3p 在体内减轻了内皮细胞炎症，从而改善 AS。

图4 MiR-29b-3p 在ApoE^-/- 小鼠中减轻 HFD 诱导的内皮炎症和 AS 。

总之，在喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠中，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 轴显著抑制单核细胞与活化的 HAECs 的粘附并减轻局部炎症和斑块形成。因此，它是预防和治疗 AS 的潜在干预靶点。

参考文献：Pu L, Meng Q, Li S, Wang Y, Sun B, Liu B, Li F. Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation. J Cell Sci. 2022 Jul 15;135(14):jcs259696. doi: 10.1242/jcs.259696. Epub 2022 Jul 22. PMID: 35735031.

原文链接：http://group9-s.ccame.net/35735031/

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