机械力在正畸牙齿移动过程中通过乳酸生成调节牙槽骨骨髓间充质细胞特性进行骨重塑

正畸牙齿移动（OTM）依赖于力诱导的骨重塑，其中在张力侧有新骨沉积，在压力侧有骨质吸收。牙槽骨骨髓间充质细胞（alveolar bone marrow mesenchymal cells，ABMMCs）是一类位于牙槽骨中的骨髓间充质干细胞，具有增殖、迁移和成骨分化特性。它们已被证明对机械力敏感，能够感知机械信号并将其转化为复杂的生物反应。因此，阐明机械力下ABMMCs中与骨重塑相关的细胞活动及其潜在机制对于正畸治疗至关重要。

由机械力引发的骨重塑是一个复杂的生物过程，需要大量的能量来合成与细胞增殖、分化和功能相关的大分子（如DNA、RNA和蛋白质）。葡萄糖已被公认为骨骼发育和生长的主要能量来源，糖酵解已被证明是满足骨重塑所需能量的主要途径。在先前的研究中，观察到在机械作用下糖酵解受刺激，葡萄糖消耗和乳酸生成增加。此外，糖酵解还为其他代谢途径提供中间物和底物，如1，6-果糖二磷酸、丙酮酸和乳酸。最近有报道称，这些中间物可以作为信号分子来调节各种细胞活动和功能。

乳酸作为糖酵解过程中产生的上述中间物之一，已被发现在生理和病理条件下发挥多种调节功能。乳酸的产生主要发生在细胞质中，它来源于乳酸脱氢酶 A（LDHA）对丙酮酸的转化。乳酸通过其转运蛋白（单羧酸转运蛋白）和受体（G蛋白偶联受体81）参与伤口愈合、内皮细胞迁移、肿瘤发展和免疫细胞极化的调节。据研究，乳酸在血液和健康组织中的生理浓度约为1.5-3 mM，但在炎症部位可升至10 mM，在癌组织中可升至近20-30 mM。然而，目前尚不清楚乳酸在OTM过程中是否因机械力而改变，或者乳酸在这种浓度下对骨重塑的影响是什么。

基于此，山东省口腔组织再生重点实验室和山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室研究团队在一项研究中，观察到在机械力下，ABMMCs的乳酸生成增加，伴随成骨分化、增殖和迁移增强，此外，发现机械拉伸衍生的乳酸能够通过组蛋白乳酸化促进ABMMCs的成骨分化、增殖和迁移，同时减少细胞凋亡。该研究结果揭示了乳酸作为OTM过程中牙槽骨重塑的介质和调节因子的关键作用，并在力相关代谢物的功能领域进行了一系列研究。具体内容发表在 CELLS期刊题为“Mechanical Force Modulates Alveolar Bone Marrow Mesenchymal Cells Characteristics for Bone Remodeling during Orthodontic Tooth Movement through Lactate Production”。

首先，研究人员在ALP染色和茜素红S染色中分别观察到成骨诱导后钙沉积和矿化结节增强，证明了ABMMCs的成骨分化潜力。油红O染色显示ABMMCs具有成脂分化的潜力。然后，评估了机械刺激对ABMMCs成骨分化的影响，在循环机械拉伸下（10% 伸长率，0.5Hz，正弦波形，6、12、24h）评估基因转录和翻译水平，结果表明成骨相关基因（ALP和RUNX2）的表达在6 h时开始增加，并在12 h时达到峰值。同时，ALP和RUNX2在蛋白水平上的表达也因机械力提高，ABMMCs细胞的ALP酶活性在循环拉伸24 h后显著增加。此外，还证实了循环机械拉伸促进ABMMCs成骨分化的能力。上述研究结果证实了ABMMCs的多向分化潜力和克隆形成能力，表明ABMMCs是可自我再生的多能细胞。

接下来，为了评估体内OTM过程中LDHA和乳酸生成的表达，实验建立了大鼠OTM模型，并观察了左上颌第一磨牙的近中移动。IHC结果显示，正畸力应用7天后，牙槽骨张力侧和压力侧LDHA的表达增加，LDHA阳性细胞百分比增加，平均光密度（AOD）增加（图1 A-C）。与压力侧相比，张力侧LDHA的表达略高，但无统计学意义（图1 A-C）。一致地，在 OTM 7 天后，移动磨牙周围的牙槽骨中的乳酸浓度也上调（图1 D）。就体外研究结果而言，实验观察到在循环张力作用12 h后ABMMCs 中 LDHA 在 mRNA 和蛋白质水平表达显著升高（图1 E-G）。此外，循环机械拉伸24h后，细胞内乳酸增加约2.5倍，细胞外乳酸达到2-3 mM（图1 H、I）。上述研究结果表明，机械力在体内和体外均能促进LDHA的表达和乳酸的产生。

图1 机械力增加乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达和乳酸的产生。
（A）通过免疫组织化学（IHC）确定 OTM 期间 LDHA 在张力侧（a）和压力侧（b）的表达。LDHA的表达由LDHA阳性细胞百分比（B）和平均光密度（AOD）（C）测定。（D）经正畸力7天后牙槽骨中的乳酸含量。（E）拉伸0、6、12和24 h后LDHA在mRNA水平上的表达。（F、G）拉伸0、6、12和24 h后LDHA在蛋白质水平上的表达。 （H）拉伸0、6、12和24 h后的细胞内乳酸浓度。（I）拉伸0、6、12和24h后的细胞外乳酸浓度。

进一步地，为了研究机械力诱导的乳酸对ABMMCs成骨分化的影响，实验应用了GNE-140（一种特异性LDHA抑制剂）来抑制循环机械拉伸过程中乳酸的产生。在循环机械拉伸期间暴露于 GNE-140 24h导致 ABMMCs 中细胞内和细胞外乳酸显著降低，但在静态条件下未发现具有统计学意义的抑制作用。GNE-140在基因转录水平和蛋白翻译水平上显著减弱了生理机械力导致的成骨标志物ALP和RUNX2的表达升高，同时，减弱了由循环机械拉伸增强的细胞内 ALP 活性和 ABMMCs 中的矿化结节。这些结果表明，通过抑制乳酸生成可以抑制ABMMCs在机械力下增强的成骨分化。上述结果揭示了，机械力诱导的乳酸可以促进ABMMCs的成骨分化。

此外，实验还评估了机械力诱导的乳酸对其他骨重塑相关细胞活动的影响，包括ABMMCs的增殖、凋亡和迁移。结果表明，循环拉伸处理24 h后，促进了ABMMCs的增殖，而GNE-140明显减弱了这种效应（图2 A）。同时，生理性周期拉伸可以诱导细胞周期进程，如S期和G2/M期细胞比例增加，而GNE-140明显抑制了这一趋势（图2 B-D）。细胞凋亡方面，在机械力作用下未观察到ABMMCs的显著改变，而GNE-140显著增加ABMMCs的凋亡（图2 E、F）。此外，生理性周期性拉伸显著诱导了ABMMCs的迁移（图2 G、H），而GNE-140可以消除ABMMCs中机械力的这种促迁移效应。这些结果表明，机械力诱导的生理性乳酸促进了ABMMCs的增殖和迁移，但抑制了细胞凋亡。上述结果揭示了，乳酸通过调节ABMMCs的细胞特性在骨重塑过程中发挥重要功能。

图2 GNE-140在循环机械拉伸下抑制ABMMCs的增殖和迁移，但促进细胞凋亡。
（A）有或没有循环机械拉伸下通过 CCK-8 测试确定 ABMMCs 在 GNE-140/DMSO 处理组中的增殖。（B-D）有或没有循环机械拉伸下GNE-140/DMSO 处理组中 ABMMCs 的细胞周期分布（B）、细胞周期分布百分比（C）以及S和G2/M期百分比（D）。（E、F）有或没有循环机械拉伸下在 GNE-140/DMSO 处理组ABMMCs 中Annexin V-FITC/PI 双染色。（G、H）有或没有循环机械拉伸下GNE-140/DMSO 处理组中 ABMMCs 划痕测定的代表性图像（G）和伤口愈合区域（H）。

最近的研究发现了一种新的组蛋白修饰，称为组蛋白乳酸化，它参与了巨噬细胞的修复性转化。由于乳酸是组蛋白乳酸化的底物，因此，实验最后研究了乳酸的上述作用是否由组蛋白乳酸化介导。在OTM过程中，乳酸化组蛋白水平在牙槽骨的张力侧和压力侧均上调，而在张力侧的表达水平明显高于压缩侧（图3 A-C）。同时，免疫荧光（IF）和WB结果也证实了ABMMCs在循环拉伸24 h后乳酸化组蛋白水平升高（图3 D-G）。这些结果表明，在机械力作用下，乳酸化组蛋白和乳酸生成之间存在相似的改变模式。

接着分析了组蛋白乳酸化与乳酸生成之间的关系。与对照组（DMSO）相比，GNE-140显著降低乳酸化组蛋白水平（图3 H-K）。此外，染色质免疫沉淀测序结果显示，GNE-140 处理组中代表性基因的转录起始位点（TSS）上游 2 kb区域中乳酸化组蛋白的富集受到抑制（图3 L）。RT-qPCR结果也进一步验证了GNE-140在ABMMCs中降低了这些基因的表达（图3 M）。这些结果表明，机械力衍生乳酸对骨重塑的调节作用是由组蛋白乳酸化介导的。因此，组蛋白乳酸化被证实为乳酸的关键介质，以发挥其在OTM期间牙槽骨重塑中的调节功能。

图3 组蛋白乳酸化介导乳酸对ABMMCs的调节作用。
（A、B）OTM 期间，IHC 在张力侧（a）和压力侧（b）测定的组蛋白乳酸化水平。组蛋白乳酸化水平由 Pan-Kla 阳性细胞（B）和 AOD（C）的百分比确定。（D、E）有或没有周期拉伸下乳酸化组蛋白的水平由 IF 确定。（F、G）有或没有周期拉伸下乳酸化组蛋白的水平由 WB 确定。（H、I）GNE-140/DMSO 处理组中由 IF 测定的乳酸化组蛋白水平。（J、K）在 GNE-140/DMSO 处理组中WB 测定的乳酸化组蛋白水平。（L）相关基因位点组蛋白乳酸化染色质免疫沉淀测序信号的基因组快照。（M）DMSO/GEN-140 组中代表基因在 mRNA 水平上的表达。

图4 拉伸刺激的乳酸通过组蛋白乳酸化促进ABMMCs中ALP、Runx2、Ki67、CCNA1、BCL2和SDF1的表达。在拉伸刺激下，ABMMCs中乳酸的产生可以升高。拉伸诱导的乳酸通过相关基因的组蛋白乳酸化进一步促进ABMMCs的增殖、迁移和成骨分化。ABMMCs：牙槽骨骨髓间充质细胞；NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；LDH：乳酸脱氢酶。

总之，该研究证实了在 OTM 期间，在机械力作用下存在生理性升高的乳酸。此外，还揭示了乳酸在调节骨重塑相关细胞活性和ABMMCs特征中的作用。研究发现了乳酸是 OTM 期间牙槽骨重塑的潜在调节因子，为改善正畸过程中牙槽骨重塑提供了新的治疗靶点。

参考文献：Zhai M, Cui S, Li L, Cheng C, Zhang Z, Liu J, Wei F. Mechanical Force Modulates Alveolar Bone Marrow Mesenchymal Cells Characteristics for Bone Remodeling during Orthodontic Tooth Movement through Lactate Production. Cells. 2022 Nov 22;11(23):3724. doi: 10.3390/cells11233724. PMID: 36496983; PMCID: PMC9738738.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36496983/

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