甲氨蝶呤对内皮细胞的作用取决于剪切应力诱导的一碳代谢调节

低剂量甲氨蝶呤（MTX，~25 mg /周）是类风湿（RA）治疗的一线药物，是目前最重要的合成类抗风湿药物（DMARD），用于治疗慢性全身炎症疾病。在炎症性关节炎患者中，使用MTX可使复合心血管疾病（CVD）事件的风险降低多达28%。然而，支持这些心脏保护作用的分子机制仍有待完全确定，并且很可能是多因素的。

MTX是一种叶酸类似物，由还原性叶酸转运体（RFC）进入细胞，并形成谷氨酸聚合体，进而影响一碳单位代谢（OCM）。一碳单位代谢将氨基酸代谢与核苷酸及一些重要物质的生物合成联系起来，这种代谢途径对于驱动胚胎发生、干细胞维持和造血、免疫细胞活化、癌症和潜在的心血管疾病至关重要。除了免疫调节作用之外，最近的临床研究还解决了该药物是否也靶向血管EC的问题。MTX单独或与肿瘤坏死因子（TNF）α阻断剂或其他DMARD联合使用，改善了炎性关节炎患者的内皮功能。虽然MTX通过OCM抑制在免疫细胞中发挥有效的抗炎作用，但其对EC的影响尚不清楚，部分原因是该途径在EC中的作用尚不明确。

内皮细胞自然暴露于流动的血液中，从而产生流体剪切应力（FSS）。然而，大多数体外研究依赖于静态EC培养，这些培养不能充分代表这些不同的内皮状态。为了解决内皮的抗炎作用是否有助于药物的血管保护作用，英国帝国理工学院国家心肺研究所、伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所、欧洲生物信息学研究所的一项新研究探讨了MTX对在促炎微环境中培养并暴露于FSS的人血管EC的分子效应，以模拟与炎症性关节炎相关的疾病和疾病相关心血管事件的风险条件。相关研究内容发表在 Frontiers in Immunology 期刊题为“The actions of methotrexate on endothelial cells are dependent on the shear stress-induced regulation of one carbon metabolism”。

首先，为了探索MTX对EC的功能影响，在静态条件下用MTX（100 nM）处理细胞，此浓度下，MTX处理未诱导EC细胞凋亡。为了了解MTX对促炎信号传导的影响，EC用TNFα预处理8小时，然后加入MTX 以模拟患者存在的促炎环境。MTX诱导51种肽的差异磷酸化，TNFα处理改变了55种肽的磷酸化，而TNFα和MTX的联合处理改变了73种肽的磷酸化模式。联合治疗组中的大多数激酶靶点与仅MTX组相同，表明MTX不抑制EC中TNFα诱导的促炎信号传导，而是独立激活内皮细胞信号通路。根据该数据，发现MTX不抑制TNFα介导的NFκB信号激活。

p38（作为MAPK家族靶点）和Akt磷酸化的变化通过免疫印迹进一步验证，因为这些途径先前与EC稳态的作用有关。鉴于接受MTX的RA患者需要联合处方叶酸以尽量减少副作用，因此在存在或不存在TNFα、添加或不添加叶酸（FA）的情况下对EC进行了研究，以扩展体外模型（图1）。在这些条件下，MTX诱导的p38 MAPK（T180/Y182）磷酸化在24小时后被FA抑制，Akt（S473）的趋势相似（图1 A、B）。FA还逆转了MTX诱导的促炎细胞粘附分子（CAM）VCAM1和ICAM1 mRNA表达，E-选择素的趋势相似（图1 C）。

由于OCM在细胞增殖中的重要性，在存在和不存在FA的情况下，研究了MTX对EC细胞周期进程的影响。在静态培养中，MTX增加了细胞周期S期的细胞百分比，降低了G2/M期的细胞百分比（图1 D、E）。单独用TNFα预处理对细胞周期进程没有影响，也不影响MTX的作用，而添加FA可防止MTX诱导的S期停滞。这些发现表明，MTX通过抑制OCM诱导静态EC中的CAM表达和细胞周期停滞。

图1 MTX通过抑制OCM抑制EC细胞周期进程。

由于剪切应力是EC功能的基本调节因子，因此，接下来探索了MTX对FSS下培养的EC中的影响（图2），EC分别进行静态培养、高剪切力（H-LSS，20 dyn/cm²）、低剪切力（L-LSS，5 dyn/cm²）或振荡剪切力（OSS，±5 dyn/cm²，2Hz）持续48h，然后在相应条件下再进行MTX处理。

作为对照，测量血栓调节蛋白（TM）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达水平，这两种蛋白质已知受EC中的剪切应力调节。暴露于OSS的EC表达较低的TM蛋白水平和较高的VCAM1水平（图2 A、B）。与静态培养细胞相比，EC暴露于延长的FSS和MTX不会诱导p38磷酸化。此外，MTX没有减弱OSS介导的VCAM1蛋白表达诱导。

此外，还在FSS下对不同处理的细胞进行了细胞周期分析。与H-LSS相比，OSS增加了EC增殖（图2 C、D）。值得注意的是，MTX处理没有改变H-LSS或OSS下EC中G1，S或G2/M期的细胞比例，这一发现与其在静态条件下诱导EC中S期停滞的能力形成鲜明对比。这些结果表明，MTX对EC的影响取决于培养条件，并且在FSS下MTX不会诱导EC中的p38磷酸化或细胞周期停滞。

OSS诱导促炎、促增殖、促血栓形成和促凋亡内皮表型。抑制这些促动脉粥样硬化作用可能有助于MTX对RA患者的心脏保护作用。为了验证这一点，EC暴露于OSS，用MTX处理并分析与血管生成、炎症、凝血、血小板活化、细胞凋亡和血管张力相关的基因。数据显示，OSS显著影响了18个基因的表达。与L-LSS相比，OSS诱导鞘氨醇激酶1（SPHK1）并降低VEGFR2（KDR）和HO1（HMOX1）表达。然而，MTX没有显著改变在这些条件下测量的任何基因的表达。值得注意的是，OSS还增加了内皮糖蛋白（ENG）、c-Kit（KIT）和整合素αv（ITGAV）的mRNA水平。

对来自基因表达阵列的关键炎症基因（包括E-selectin，VCAM1，ICAM1和CCL2）的分析显示MTX治疗没有显著影响。因此，在平行平板流动模型中对OSS调控的关键内皮基因的评估表明，在这些促动脉粥样硬化条件下，MTX对血管内皮没有直接的抗炎作用。

图2 MTX不影响FSS下EC的细胞信号传导或细胞周期进程。

最后，为了理解为什么MTX在FSS下对EC有不同的影响，实验试图确定FSS是否改变了内皮OCM，在基因和蛋白质水平上分析暴露于FSS的EC中所选的OCM靶点的表达（图3）。与静态EC相比，H-LSS增加了KLF2和TM的mRNA水平，而OSS增加了VCAM1的表达（图3 A）。通过qPCR检测，FSS改变了叶酸转运和聚/去谷氨酸化、细胞质和线粒体OCM相关基因的表达。在细胞质OCM途径中，与静态条件相比，H-LSS和OSS均降低了叶酸代谢酶相关基因DHFR、TYMS和MTHFD1的转录水平（图3 B）。与静态细胞相比，H-LSS降低了线粒体中叶酸一碳单位代谢途径中关键酶MTHFD1L、SHMT2、MTHFD2的表达。FSS对叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的线粒体亚型没有影响，而H-LSS显著降低了γ谷氨酰水解酶（GGH）。叶酸转运蛋白SLC19A1被H-LSS降低，不受OSS影响，表明H-LSS和OSS之间存在调节差异（图3 B）。对选定的OCM靶点进行免疫印迹，暴露于FSS后，DHFR的蛋白表达降低了≥60%（图3 C、D），MTHFD2蛋白表达遵循类似的趋势。

接下来，通过UPLC-MS对叶酸代谢物进行定量。UPLC-MS显示，与静态条件相比，FSS培养的EC中叶酸总量减少了75%。当检查每种叶酸占总叶酸的比例时，5-甲基四氢叶酸（5-meTHF）水平不受剪切应力影响。相比之下，H-LSS和OSS降低了THF，5,10-me+THF和5,10-meTHF水平，而二氢叶酸（DHF）则检测不到。嘌呤和线粒体蛋白合成所需的10-甲酰基-THF通过H-LSS和OSS增加。

这些实验表明，内皮OCM在很大程度上被FSS抑制。总体而言，尽管内皮OCM在静态条件下对维持EC稳态和调节增殖很重要，但FSS对OCM的抑制作用足以改变MTX对血管内皮的影响。

图3 内皮细胞OCM受剪切应力下调。

图4 图形摘要。（A）在静态条件下，MTX被吸收到EC中并抑制内皮OCM，从而诱导炎症激活并抑制EC增殖。（B）在动脉粥样硬化保护下，单向高层流剪切应力（H-LSS）下内皮OCM下调，包括主要的MTX转运蛋白RFC。在这些条件下，MTX不影响内皮增殖。（C）扰动剪切应力（振荡剪切应力OSS）也下调内皮OCM。虽然MTX可以在这些条件下被吸收，但它对OSS诱导的EC促炎激活或增殖没有影响。

这是第一份报告显示，在生理剪切应力条件下，EC中OCM关键组分的组成型表达较低。剪切应力的抑制逆转了MTX在静态培养下EC功能中观察到的影响。这些发现并没有否定MTX的有益作用，但表明MTX在全身性炎症性疾病患者中报告的心脏保护作用不是通过对血管内皮的直接作用介导的，而是通过靶向其他细胞类型的炎症反应介导的。目前，进一步的研究表明要精确定义MTX在血管系统中的环境依赖性和细胞特异性作用，并确定其直接和间接的心脏保护益处，最终旨在患者分层和靶向治疗。

参考文献：Lang MB, Leung KY, Greene NDE, Malone KM, Saginc G, Randi AM, Kiprianos A, Maughan RT, Pericleous C, Mason JC. The actions of methotrexate on endothelial cells are dependent on the shear stress-induced regulation of one carbon metabolism. Front Immunol. 2023 Jun 30;14:1209490. doi: 10.3389/fimmu.2023.1209490. PMID: 37457690; PMCID: PMC10349526.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37457690/

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