内毒素诱导的ECM-受体相互作用通路信号对Caco2/HT29共培养细胞中MUC2功能的影响

细菌内毒素是在革兰氏阴性细菌的细胞壁上发现的有毒物质。脂多糖（LPS）是内毒素的主要有毒物质，紧密结合到其细胞壁的最外层，当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。人类胃肠道具有大量复杂的共生和有害革兰氏阴性细菌，当肠黏膜屏障完好时，它们不会损害肠腔。然而，当肠黏膜免疫屏障受损时，许多内毒素会转移到血液中，引起内毒素血症。因此，确保肠黏膜屏障的完整性是防止内毒素易位的关键。

在肠道组织结构中，杯状细胞分布于整个肠道，杯状细胞能够分泌黏蛋白（黏蛋白-2（MUC2）是肠黏液层主要成分），高度糖基化的黏蛋白分布于细胞膜或者分泌进肠腔中，形成黏液层。病原微生物必须先突破黏液层才能到达上皮细胞，因此，黏液层是肠道屏障的第一道防线，能够保护肠道上皮细胞免受病原微生物的侵袭。先前的研究表明，在黏液层存在的情况下，内毒素不会损害肠上皮细胞。假设黏液层的缺失是由内毒素易位到肠上皮细胞引起的。然而，在没有黏液层的情况下首先被内毒素破坏的上皮细胞的结构和功能尚不清楚。

在西北农林科技大学动物医学院、榆林学院生命科学学院的一项联合研究中，基于肠道屏障功能，建立了Caco-2和HT-29共培养细胞模型，对肠道黏液层内毒素的作用机制进行探索。此外，采用siRNA转染分析、RNA-seq、qPCR、ELISA和免疫荧光分析评估了LPS处理后Caco-2/HT-29细胞共培养的增殖、结构、功能和机制。研究结果反映了内毒素对肠黏膜屏障作用的调控机制，为深入了解肠黏膜免疫屏障功能提供了思路。相关内容发表在 Frontiers in Immunology 期刊题为“Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells”。

HT-29细胞常用作体外杯状细胞模型，可产生黏蛋白分泌物，形成细胞外黏液层。Caco-2（人结肠腺癌细胞）结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，可以用来进行模拟体内肠转运的实验。研究人员选择Caco-2和HT-29在Transwell腔室中共培养的组合，以确保建立的肠上皮模型具有黏液层（图1 A）。ALPi是Caco-2细胞分化的标志物，MUC5AC是HT-29细胞分化的标志物，MUC2是形成黏液层骨架的主要成分。在15天分化过程结束时，Caco-2/HT-29（3：1）共培养物中的 MUC2 和 MUC5AC mRNA 表达相对于 Caco-2/HT-29 （9：1）共培养物中的表达显著增加（图1 B、C）。这些数据表明，Caco-2：HT-29 接种比率为 3：1 在腔室15 天分化结束时黏液屏障最佳。

此外，为了确认LPS的最佳时间和剂量对黏液屏障功能的影响，在Caco-2/HT-29共培养分化15天后，使用100、200、400、800和1000 μg/mL LPS分别在12、24、36、48小时刺激Caco-2/HT-29共培养细胞。根据观察结果，后续测试选择400 μg/mL LPS刺激Caco-2/HT-29共培养细胞。实验还观察到，LPS（+）组在LPS刺激12、24、36和48 小时后，与LPS（-）组相比，黏蛋白分泌显著增加。此外，使用免疫荧光检测，评估了不同时间点Caco-2 / HT-29共培养细胞中Occludin 跨膜蛋白的表达，以评估紧密连接。LPS（-）组中Caco-2/HT-29细胞在24、36和48小时具有良好的细胞膜连接性，相反，LPS（+）组细胞膜连接受损。这些结果表明，LPS（-）和LPS刺激24小时的LPS（+）组的Caco-2/HT29共培养细胞中的黏蛋白分泌和Occludin表达显著增加。

图1 建立Caco2/HT-29细胞共培养模型。（A）Caco-2 / HT-29共培养细胞模型的Transwell。（B）Caco-2/HT-29共培养细胞在两种细胞接种比例下MUC2、MUC5AC和ALPi mRNA表达。（C）两种细胞接种比例下的Caco-2/ HT-29共培养细胞的图像。

接下来，为了了解黏液层的功能，使用RNA干扰（RNAi）来沉默Caco-2/HT-2共培养细胞中的MUC2基因，评估MUC2 mRNA和蛋白质表达。Caco-2/ HT-29共培养分化15天后，在24、36、48和60小时用LPS（LPS +）或0.01M PBS （LPS-）刺激细胞。LPS（+）组和LPS（-）组MUC2 mRNA和蛋白质在24小时时的表达水平高于其他时间点。因此，Caco-2/HT-29共培养细胞在LPS刺激24小时前用Lipofectamine™2000转染siRNA MUC2构建物。这些综合结果表明，用siRNA转染和LPS刺激24小时后，MUC2 mRNA表达显著增加。因此，在下面的测试中，所有共培养的细胞被分为三组，即LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）。

为了深入了解LPS对黏液层的调控机制，实验使用RNA-seq技术分析了LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）组中的不同基因和KEGG富集途径。在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）组中共发现了1611个上调基因和1379个差异表达基因。在LPS（-）组与 siMUC2 + LPS（+）组中分别有1417个和1904个基因上调和下调，LPS（-）组与 LPS（+）组分别有71个基因上调和82个基因下调（图2 A）。在 LPS（-）与 siMUC2 + LPS 组和 LPS（+）与 siMUC2 + LPS 组之间共发现1953个差异表达基因（图2 B）。通过KEGG富集分析测定LPS（-）与 siMUC2 + LPS 组和 LPS（+）与 siMUC2 + LPS 组的前20条信号通路（图2 C）。利用细胞外基质（ECM）受体相互作用和黏着斑信号通路进一步研究黏液层功能机制。

图2 LPS（+）组、LPS（-）组和siMUC2+LPS（+）组的RNA-seq。（A）LPS（+）与siMUC2+LPS（+）组、LPS（-）与siMUC2+LPS（+）组、LPS（-）与LPS（+）组中不同基因的数量，红色表示上调基因，蓝色表示下调基因。（B）LPS（+）与siMUC2+LPS（+）组、LPS（-）与siMUC2+LPS（+）组、LPS（-）与LPS（+）组中不同基因簇的维恩分析。（C）LPS（+）与siMUC2+LPS（+）组（右列）和 LPS（-）与 siMUC20+LPS（+）组（左列）的 KEGG 富集分析。

最后，为了了解参与ECM-受体相互作用和黏着斑通路的不同基因，使用qPCR测量了这些因子在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）组中的mRNA表达。结果表明，与siMUC2 + LPS组相比，LPS（+）组Claudin-1、ZO-1、JAMA、Desmosome、Occludin和E-cadherin 的mRNA表达水平显著升高；FN1，ITGAV，COL6A2，LAMC1，LAMA5，LAMB2，AGRN，ROCK1，ITGB2，ITGB4，ACTB-P1，CD44，ARHGAP5，HSPG2，DAG1和SRC的mRNA表达水平显著增加。LPS（+）组和 siMUC2 +LPS（+）组之间 ITGB3、ROCK2 和 RhoA 的 mRNA 表达量无差异。

图3 ECM受体相互作用和黏着斑信号通路的图像。（A）肠上皮细胞黏液层结构、细胞间黏附及细胞-基质黏附。（B）ECM受体相互作用和黏着斑信号通路差异因子的相互作用机制。

总之，除了能够建立Caco-2/HT-29模型的数据外，该研究还支持其作为评估肠道黏液屏障的有力工具的使用。在共培养细胞中，发现LPS（400 μg/ mL）刺激24小时后，可破坏MUC2基因沉默下ECM介导的黏着斑信号通路的调节机制。当黏液层不完整时，LPS首先破坏上皮细胞的紧密连接，通过ECM向下游传递信号调控细胞表面受体的整合素，抑制整合素介导的黏着斑结构，进一步破坏ECM网络结构和细胞内肌动蛋白微丝骨架。最终，LPS抑制ECM和细胞骨架之间的相互作用。通过结合这些数据，黏液屏障的保护功能有望在未来得到很好的表征。

参考文献：Hu W, Feng P, Zhang M, Tian T, Wang S, Zhao B, Li Y, Wang S, Wu C. Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells. Front Immunol. 2022 Jun 10;13:916933. doi: 10.3389/fimmu.2022.916933. PMID: 35757703; PMCID: PMC9226665.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35757703/

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