体外模型揭示了免疫细胞亚型与人睾丸精原细胞瘤细胞系TCam-2之间的相互作用

睾丸生殖细胞癌（TGCC）年轻男性中最常见的恶性肿瘤，病理学上主要分为精原细胞瘤（SGCT）与非精原细胞瘤（NSGCT）两大类。SGCT 的特征尤其表现为由淋巴细胞和单核/巨噬细胞组成的炎症浸润。单核/巨噬细胞和T细胞是TGCC浸润免疫细胞的大多数。这些肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）的作用以及它们是否有助于患者良好的总生存期（OS）的问题被广泛未知。据研究，由各种免疫细胞类型、成纤维细胞和内皮细胞组成的肿瘤微环境（TME）是精原细胞瘤“余烬性”表型的原因，或至少影响临床结局。

由于没有TGCC动物模型可用于研究免疫系统与肿瘤之间的相互作用，因此基于TGCC细胞系的体外系统是目前解决此问题的最佳选择。Tcam-2细胞系与人精原细胞瘤细胞有许多共同特征，但根据微环境的不同，它们会转化为类似于胚胎癌（EC）的表型。另据报道，TGCC中的TME本质上是促炎的，在基于全外周血单核细胞（PBMC）与Tcam-2细胞共培养的体外模型中显示，TME的细胞因子环境立即发生了变化。这些实验证实促炎细胞因子IL-6在睾丸癌中起重要作用，但PBMC中所含单个白细胞亚群的贡献尚不清楚。

虽然免疫细胞对TGCC的影响是毋庸置疑的，但免疫细胞亚群与生殖细胞癌细胞之间的相互作用尚未详细描述。目前尚不清楚TGCC中的肿瘤细胞是否对T细胞和单核/巨噬细胞产生相似或相反的作用，也不知道免疫细胞是否也会相互改变肿瘤细胞的特征。为了解决这些问题，德国哥廷根大学医学中心的研究团队曾利用从不同健康供体的外周血中分离的T细胞和单核细胞进行了共培养实验，通过这种方法，可以获得关于免疫相关机制的新见解，可能有助于TGCC患者精原细胞瘤的进展。相关内容发表在 Cells 题为“A Coculture Model Mimicking the Tumor Microenvironment Unveils Mutual Interactions between Immune Cell Subtypes and the Human Seminoma Cell Line TCam-2”。

众所周知，肿瘤细胞能够诱导免疫抑制性TME，从而促进肿瘤细胞的增殖。然而，发现与肿瘤细胞接触的免疫细胞被激活并引发炎症反应。为了在体外模型中解决这个问题，实验首先表征了与精原细胞瘤样Tcam-2细胞系共培养后T细胞活性的变化，观察到共培养中具有活化表型的高表达CD25的CD3+CD4+ T细胞亚群百分比增加。为了证实观察结果，进行了基因表达分析。总的数据显示，Tcam-2细胞诱导T细胞活化，从而促进促炎TME。

一般而言，TME中的单核细胞倾向于采用抗炎M2表型并分化为所谓的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。为了表征TGCC细胞在TME中重编程单核细胞的能力，进行了共培养实验。流式细胞术分析显示，与Tcam-2细胞共培养24小时的单核细胞表面CD25和CD163水平显著升高，表明表型活化（图1）。进一步的分析表明，促炎M1标志物IL1B和NOS2在共培养的单核细胞中强烈上调，而两种抗炎M2标志物ARG1和CD206则未改变甚至下调。趋化因子CCL2的基因表达也未见变化。这些结果表明，Tcam-2细胞有效地诱导单核细胞活化并极化为促炎M1表型。

图1 与TCam-2细胞共培养的外周血单核细胞的流式细胞术分析。（A）单核细胞分析的示例性门控策略。（B）CD25（上）和CD163（下）在单独培养（红线）和与TCam-2细胞共培养（蓝线）的单核细胞表面表达直方图。（C）量化每种条件下CD25+ 单核细胞（上）或CD163（下）的平均荧光强度。

细胞因子在肿瘤进展和转移中起核心作用。先前的研究揭示了IL-6在睾丸癌中的关键参与以及TNFα在细胞凋亡、存活和炎症方面的多功能性。接下来深入了解了这两种细胞因子在Tcam-2细胞与单个免疫细胞亚型之间相互作用中的功能。在T细胞与Tcam-2细胞共培养中检测到IL-6分泌，基因表达分析证实，T细胞而不是Tcam-2细胞是IL-6的主要来源，T细胞共培养的上清液中检测不到TNFα。重要的是，在单核细胞与Tcam-2细胞共培养中观察到大量IL-6 和TNFα分泌。这表明精原细胞瘤细胞对免疫细胞激活的反应所建立的促炎环境由单核细胞衍生的介质主导的。基因表达分析证实，共培养中产生的两种细胞因子主要来自活化的单核细胞，而不是Tcam-2细胞。这些数据表明，免疫细胞受到精原细胞瘤细胞的刺激，从而可能促进TME中的促炎状况。

然后，为了研究免疫细胞是否对肿瘤细胞的表型可塑性有影响，分析了共培养的Tcam-2细胞中基因表达的变化。与T细胞共培养的Tcam-2细胞中观察到EC标记物SOX2和多能性标记物NANOG和OCT2的mRNA水平显著增加（图2 A）。相反，无论是否存在T细胞，SOX17（精原细胞瘤细胞的标志物）的mRNA水平在Tcam-2细胞中相似。有趣的是，单核细胞诱导的变化不那么明显（图2 B）。这一发现表明，单个免疫细胞亚群对TGCC细胞的干性有不同的影响，并且T细胞似乎特别介导从精原细胞瘤到胚胎癌表型的转变。

图2 TCam-2细胞与免疫细胞共培养中多能性标志物的基因表达分析。从与 T 细胞共培养（A）、与MC 共培养物（B）或单独培养的TCam-2 细胞中收集的 TCam-2细胞中 SOX2、SOX17、OKT4和 NANOG 的相对 mRNA 水平表示为点图。

考虑到已知TME会影响肿瘤行为，因此研究了参与增殖和细胞周期活性的关键基因。与T细胞共培养的Tcam-2细胞中的KI67和MCM3 mRNA水平显著上调，这表明T细胞可能能够刺激肿瘤生长（图3）。此外，在成人TGCC中高表达的细胞周期调节因子CDK4、与转移相关的基因VEGFA的mRNA水平在与T细胞共培养的Tcam-2细胞中均上调（图3 A），这表明T细胞可能增加精原细胞瘤细胞的侵袭性（图3 A）。同样，单核细胞对Tcam-2细胞的影响要小得多，甚至似乎减少了增殖（图3 B）。这些数据表明，精原细胞瘤中的T细胞浸润可能促进其增殖，因此TME中免疫细胞的组成可能会影响肿瘤的预后。

最后，实验开始测试观察到的KI67，MCM3和CDK4表达的差异是否导致细胞生长的可测量变化。与增殖活性标记基因的mRNA水平增加一致，与单独培养的TCam-2细胞相比，与T细胞共培养的TCam-2细胞数量增加15%。实验观察到的细胞数量增加支持以上结论，即TIIC影响肿瘤生长。

图3 分析TCam-2细胞与免疫细胞共培养中增殖和转移潜能标志物的基因表达。从 与T 细胞共培养（A）、与MC 共培养（B）或单独培养的TCam-2细胞中收集的 TCam-2 细胞中 KI67、MCM3、CDK4和 VEGFA 的相对 mRNA 水平表示为点图。

在这项研究中，该团队在体外共培养模型中表征了纯化的免疫细胞亚型与精原细胞瘤细胞的相互作用。首次能够证明精原细胞瘤细胞能够通过激活T细胞和单核细胞来诱导强烈的促炎性TME。相反，精原细胞瘤的增殖和可能的转移潜力受到T细胞的影响，这也引发了表型转变为去分化EC样命运。这些结果清楚地表明，单个免疫细胞亚型在精原细胞瘤TME的体外模型中发挥选择性作用，并在决定这种肿瘤实体的行为和命运中揭示了它们的特定作用。

参考文献：Gayer FA, Fichtner A, Legler TJ, Reichardt HM. A Coculture Model Mimicking the Tumor Microenvironment Unveils Mutual Interactions between Immune Cell Subtypes and the Human Seminoma Cell Line TCam-2. Cells. 2022 Mar 4;11(5):885. doi: 10.3390/cells11050885. PMID: 35269507; PMCID: PMC8909655.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35269507/
Impact Factor: 6.0 (2022); 5-Year Impact Factor: 6.7 (2022)
ISSN: 2073-4409

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