缺氧和炎症损伤后间充质基质细胞对内皮细胞的修复作用

移植器官的缺血再灌注损伤（IRI）是无法避免的，并可引发炎症级联反应，导致器官功能障碍。IRI 会影响来自循环系统死亡后捐赠的器官以及年龄超过60岁并伴有高血压等并发症的扩大标准捐赠者的器官。IRI 尤其会导致内皮细胞的损伤，导致它们的激活和内皮壁完整性和功能的丧失。

间充质基质细胞（MSC）可能代表一种独特的细胞工具来修复受损的内皮。MSC 是存在于成人人体大多数组织中的多能细胞，这些细胞以其再生和抗炎特性而闻名。因此，正在研究 MSC 作为肾脏疾病和人体移植的治疗剂。几项 I 期试验表明，MSC 治疗是安全的，并表明它们的免疫调节和再生特性可能会改善肾移植结果。与肾脏微血管的相互作用是MSC再生作用的起点，因此了解MSC与内皮细胞相互作用的机制至关重要。更好地了解这些相互作用将使我们能够优化 MSC 疗法对内皮损伤的潜在再生作用。

在这里，鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心内科部-肾脏病学和移植、丹麦奥胡斯大学医院临床免疫学系、牛津大学纳菲尔德外科学系等课题组研究了 MSC 对内皮细胞的潜在修复作用，这些细胞受到缺氧和炎症损伤，并测试了 MSC 和内皮细胞的物理或旁分泌相互作用是否负责 MSC 的再生作用以及涉及哪些分子。

MSC 通过 CD29 和 CD44 迁移并黏附于内皮细胞

实验首先测试了 MSC 向内皮细胞的迁移能力，将 MSC 添加到上孔中，HUVEC 在下孔中生长至汇合（图1 a）。6 小时后，39% 的 MSC 向未损伤的 HUVEC 迁移。HUVEC 暴露于缺氧和复氧导致 61% 添加的 MSC 向 HUVEC 迁移（图1 d）。

图1 MSC的迁移和黏附。

在静态条件下测试 MSC 黏附 HUVEC 的能力，将 MSC 在 HUVEC 的单层上孵育 10、30 和 60 分钟（图1 b）。与未损伤的 HUVEC 相比，MSC 在所有时间点显示出对损伤 HUVEC 的黏附能力增加（图1 e）。重要的是，MSC 在流动条件下也表现出对 HUVEC 的黏附能力（图1 c）。HUVEC 在灌注载玻片中培养和损伤。向灌注载玻片单次或双次输注 MSC，导致黏附率不到添加的 MSC 的30%。MSC 在同一系统中的再循环使 MSC 与 HUVEC 反复接触，导致 74% 的 MSC 附着在损伤的 HUVEC 上（图1 f）。

MSC和HUVEC相互作用的拟议机制如图2 a所示。在缺氧和复氧损伤后，HUVEC 膜上的 CD62e 和 CD106 表达水平上调（图2 b）。同时，它们的配体CD29和CD44在与损伤的HUVEC孵育后在MSC的细胞膜上被上调（图2 c）。为了测试这两种分子对 MSC-HUVEC 相互作用的重要性，阻断了它们在 MSC 表面的结合位点。通过阻断抗体阻断 CD29 和 CD44 可抑制 MSC 与 HUVEC 的黏附（图 2d），而不影响通过台盼蓝评估的 MSC 的存活。

图2 MSC-HUVEC 粘附机制。

MSC减少缺氧复氧后内皮细胞的损伤标志物

为了检查缺氧复氧对内皮细胞的影响，在缺氧和炎症条件下研究了 HUVEC 的存活和代谢。在此过程后，几种损伤标志物上调，包括黏附分子 CD54 和 CD146、血管生成受体如 Tie-2 和 VEGFR2，以及 HLA-II，HLA-II 通常在内皮细胞损伤后上调（图3 a-d）。损伤后ROS的释放也增加（图3 e）。

将受损的 HUVEC 与 MSC、失去其分泌因子能力的 HI-MSC 或在 transwell 膜顶部的 MSC 以 MSC-HUVEC 1:2 或 1:10 的比例孵育 24 小时。以 1:2 的比例与 MSC 孵育可将受损 HUVEC 上 CD54、CD146、Tie-2 和 HLA-II 的表达降低至接近未损伤 HUVEC 的水平，而 1:10 比例与 MSC 孵育未观察到影响（图3 a-d）。在 1:2 的 MSC-HUVEC 比率下，MSC 还将 HUVEC 产生的 ROS 水平降低了 60%（图3 e）。当损伤的 HUVEC 与 HI-MSC 或通过 transwell 膜分离的 MSC 一起孵育时，未观察到对 HUVEC 表面标志物或 ROS 水平的影响。

图3 MSC 减少损伤的 HUVEC 上的损伤标志物。

MSC 改善受损内皮细胞的伤口愈合、屏障和血管生成功能

为了测试缺氧-复氧对 HUVEC 单层膜渗透性的影响，使用 FITC 标记的葡聚糖外渗法来评估葡聚糖是否通过受损的 HUVEC 单层渗漏（图4 a）。与未损伤的 HUVEC 相比，缺氧-复氧增加了内皮单层通透性3 倍（图4 d）。MSC 将内皮细胞单层通透性降低了 60%，而 HI-MSC 和用 transwell 膜从 HUVEC 中分离的 MSC 却没有做到这一点。未观察到较低的MSC比率的影响（图4 d）。

HUVEC 修复单层划痕的能力，是衡量其伤口愈合能力的指标，这在缺氧和复氧后急剧下降（图4 b）。高 MSC 比率的孵育显示可刺激损伤的 HUVEC 修复划痕的能力提高 45%，而低比率的 MSC 将此能力提高 17%。此外，通过 transwell 培养的 MSC 对 HUVEC 的划痕修复能力具有较小的剂量依赖性影响（图4 e）。

此外，HUVEC 的血管生成潜力是通过它们在体外形成管的能力来测量的，与未损伤的内皮细胞相比，其降低了 50%（图4 c）。以 1:2 的比例添加 MSC 完全恢复了 HUVEC 血管生成潜力，而以 1:10 的比例添加 MSC 将这种能力提高到未损伤 HUVEC 潜力的 50%。HI-MSC 没有引起修复作用。此外，通过 transwell 膜从损伤的 HUVEC 中分离出的高剂量 MSC 将其血管生成能力提高了 48%（图4 f）。

图4 MSC 修复损伤 HUVEC 的伤口愈合能力、屏障功能和血管生成特性。

MSC 在体外通过内皮单层迁移

实验继续检查 MSC 通过 HUVEC 单层的迁移，如图5 a所示，这可能允许 MSC 向内皮下的组织提供再生信号。MSC 在6小时后没有显示出通过内皮细胞单层的迁移能力，在内皮单层下方没有趋化信号（图5 b）。尽管如此，在将 SDF-1α 添加到 transwell 系统的下孔后，MSC 能够通过 HUVEC 单层迁移。6 小时后，添加的 38% 的 MSC 通过 HUVEC 的单层迁移（图5 b）。HUVEC损伤时，MSC的迁移能力增强。这些体外实验表明，MSC 有可能通过内皮细胞并朝着趋化信号梯度迁移到组织中。

图5 MSC 通过内皮单层向肾损伤趋化因子 SDF-1α 迁移。

图6 这些结果表明，MSC 需要通过物理和旁分泌相互作用的机制对受损的 HUVEC 具有再生作用。鉴定参与 MSC-HUVEC 相互作用的特定效应分子将允许对 MSC 进行靶向修饰，以应用和增强 MSC 在 IRI 中的治疗效果。

该研究得出结论，MSC 具有控制与内皮细胞缺氧-复氧损伤相关的损伤的能力，前提是它们可以进行物理相互作用和通过分泌分子相互作用。研究结果表明，MSC 是修复 IRI 的一种有价值的治疗选择，未来的研究将揭示 MSC 是否以及如何应用于移植前后的器官修复。

参考文献：Sierra-Parraga JM, Merino A, Eijken M, Leuvenink H, Ploeg R, Møller BK, Jespersen B, Baan CC, Hoogduijn MJ. Reparative effect of mesenchymal stromal cells on endothelial cells after hypoxic and inflammatory injury. Stem Cell Res Ther. 2020 Aug 12;11(1):352. doi: 10.1186/s13287-020-01869-3. PMID: 32787906; PMCID: PMC7424997.

原文链接：http://group9-s.ccame.net/32787906/

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