血管内皮细胞对氧化应激的防御由转录因子 Nrf2 协调，它通过与称为抗氧化反应元件（ARE）的 DNA 序列结合来调节抗氧化基因表达。在正常生理条件下，Nrf2 存在于与阴性调节蛋白 Kelch 样 ECH 相关蛋白1（Keap1）相关的细胞质中，该蛋白与 Nrf2 相互作用并充当衔接蛋白，将 Nrf2 维持在低水平，并允许其在泛素介导的过程中通过蛋白酶体连续降解。
高单向剪切应力（USS）促进内皮 Nrf2 信号传导，而暴露于低振荡剪切应力（OSS）的动脉区域容易发生动脉粥样硬化，部分原因是内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达减少并减弱 Nrf2 激活的抗氧化和抗炎特性。尽管剪切敏感的 Nrf2 的调节在决定血管疾病的易感性中起关键作用，但这种作用的生物力学介质仍有待充分阐明。糖萼（GCX），主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖（GAG）、膜糖蛋白及血浆蛋白组成。GCX 通过其机械传导特性有助于调节血管张力，对于微循环中的血液流变学、跨血管壁的分子过滤以及血栓抵抗和免疫调节至关重要。唾液酸（SIA）单糖占据了 EC、血细胞和常见病原体 GCX 内的聚糖链的末端分支。暴露于扰动剪切应力的动脉段表现出 SIA 恶化，这使它们易于发生动脉粥样硬化。值得注意的是，外源性唾液酸酶对 EC 的脱硫酰化作用由于增强了 ROS 的生成，已被证明在剪切应力作用下损害 NO 依赖性血管舒张，然而，SIA 在剪切介导的内源性抗氧化防御诱导中的作用仍有待阐明。伦敦国王学院英国心脏基金会卓越研究中心、生物医学工程与成像科学学院在一项研究中，报告了流体剪切应力通过改变 GCX 的 SIA 成分来调节 EC 氧化还原信号的第一个证据。通过使用原代人类 EC，实验证明了在 USS 和 OSS 下 SIA 的不同表达和 Nrf2 介导的抗氧化反应。文章名为《Glycocalyx sialic acids regulate Nrf2-mediated signaling by fluid shear stress in human endothelial cells.》
由于静态培养不代表血管系统中的动态条件，实验将 HUVEC 暴露于层流中，以更准确地概括生理 GCX 环境。TEM 显示，静态培养中的 HUVEC 具有基本水平的 GCX，在长时间暴露于 USS 后 GCX 变得更均匀和更厚。SIA 是血管 GCX 的主要组成部分，在暴露于扰动剪切应力分布的血管系统的动脉粥样硬化易发区域中显著减少。鉴于人脐静脉中 SIA 的丰度，接下来使用 WGA 凝集素标记来评估其表达。静态细胞在不同的传代中均有丰富的 SIA 表达，而 USS 的应用增强了 SIA 水平，暴露于 OSS 的细胞中 WGA 强度降低。
OSS 和 SIA 的破坏通过生理流动减弱抗氧化剂 Nrf2 信号的激活
最具特征的 Nrf2 靶标之一是血红素加氧酶-1（HO-1），它是一种应激反应酶，转录上调以提供针对氧化损伤的保护。HO-1 在暴露于流动的 HUVEC 中上调，但对生理 USS 的反应明显更大。USS 介导的 HO-1 蛋白表达的诱导在 Nrf2 敲低的细胞中被消除。由于酶促去除 SIA 增强了 ROS 的产生，接下来研究这是否是由于 Nrf2/ARE 通路的机械敏感性调节。首先选择性地去除 GCX 的 SIA 成分，用 2U ml-1神经氨酸酶处理细胞30min。对照组和神经氨酸酶处理的培养物进行不同时间 USS 处理。两种处理条件下，与 8h 相比，细胞暴露于 USS 在 24h 增强了 WGA 染色。神经氨酸酶处理至少 8h 内显著降低 WGA 染色，但在 24h 后观察到显著的 SIA 恢复。为了避免持续暴露于神经氨酸酶引起的细胞毒性，使用急性 SIA 恢复期（<8h）来评估其在 Nrf2 信号传导中的作用。用神经氨酸酶去除 SIA 减弱了 6h USS 对 HO-1、NQO1 和 GCLM 蛋白水平的诱导。然而，在 24h 后，层流剪切应力对这些酶的诱导作用恢复，伴随着 SIA 的再生。
SIA 去除会破坏 Nrf2 核积累以响应生理流动
实验接下来研究了 SIA 调控 Nrf2 信号传导的机制。USS 稳定新合成的 Nrf2 蛋白并增强其核积累，这是在 USS 应用 4h 后观察到的。用神经氨酸酶去除 SIA 显著降低了暴露于 USS 的细胞中的 Nrf2 水平。此外，神经氨酸酶减弱了 USS 诱导的 Nrf2-Ser40 的磷酸化。在对生理流的反应中，后一种机制由蛋白激酶B（Akt）活性介导。事实上，HUVEC 急性暴露于 USS 刺激了 Akt 磷酸化，在用神经氨酸酶切割 SIA 后，Akt 磷酸化显著降低。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 通路的激活可通过抑制糖原合酶激酶3β（GSK3β）进一步促进 Nrf2 活性。当在 USS 暴露前用神经氨酸酶处理 HUVEC 时，GSK3β 在 Tyr216 位点的磷酸化增加。
为了进一步研究 SIA 在剪切应力介导的 Nrf2 信号调节中的作用，实验沉默了内源性唾液酸酶 NEU1。由于 NEU1 表达以前与细胞表面去硫化有关，接下来评估 NEU1 沉默对 SIA 水平的影响。在 EA 中，用对照 shRNA 转染 hy926 细胞，OSS 比 USS 在更大程度上增强 NEU1 蛋白表达，而与静态培养相比，NEU1 敲低细胞的流动调节没有改变唾液酸酶水平。NEU1 敲低显著增强了暴露于 USS 细胞中的 SIA 免疫荧光，与层流相比，SIA 水平因受干扰而减弱。此外，在没有 NEU1 的情况下，增强的 SIA 表达与响应 USS 的 Nrf2 靶酶 HO-1、NQO1 和 GCLM 的上调有关。
总之，该研究结果为内皮 GCX 维持 Nrf2 介导的氧化还原稳态的分子机制提供了新的见解，并强调了靶向 SIA 代谢以改善动脉粥样硬化和年龄相关 CVD 中的血管功能障碍的治疗潜力。这表明 GCX 不仅可以作为相关心血管疾病的治疗靶点，而且还可能是感染性疾病、癌症和糖尿病的关键治疗靶点。
图形概括
参考文献：Psefteli PM, Kitscha P, Vizcay G, Fleck R, Chapple SJ, Mann GE, Fowler M, Siow RC. Glycocalyx sialic acids regulate Nrf2-mediated signaling by fluid shear stress in human endothelial cells. Redox Biol. 2021 Jan;38:101816. doi: 10.1016/j.redox.2020.101816. Epub 2020 Nov 28. PMID: 33340902; PMCID: PMC7750408.原文链接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33340902/
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