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循环机械拉伸通过促进ITGA2/PI3K/AKT信号通路改善髓核细胞退变

椎间盘(IVD)是连结相邻两个椎体的纤维软骨盘,由3个部分组成:髓核(NP)、纤维环(AF)和软骨板(CEPs)。NP的退变被认为是椎间盘退变(IVDD)的关键步骤。退变的NP变成无组织的纤维组织团块,细胞外基质(ECM)成分发生改变,主要失去其结合水的能力。退变的NP内的压力降低,椎间盘高度降低,导致IVDD和脊柱生物力学不稳定。NP在IVDD期间经历了最高程度的重塑。


大量复杂因素导致椎间盘退化,通常涉及生物力学和生物机制之间的协同相互作用。在它们的相互作用过程中,力学因素、细胞生物代谢反应和水结合ECM在退化中起重要作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT通路控制许多基本的细胞功能,并参与调控转录、翻译、细胞增殖、分化、细胞周期和凋亡。据报道,PI3K/AKT通路参与调节NP细胞增殖、凋亡、衰老和ECM代谢,并且还显示其与NP变性显著相关。然而,调控NP退变的机制和生物相互作用机制尚未深入探讨。


基于此,山东第一医科大学附属颈肩腰腿痛医院、山东中医药大学、河南中医药大学第二临床医学院、中国人民解放军第960医院等研究团队的一项研究曾探讨了循环机械拉伸对NP细胞生物学功能的影响,以及ITGA2/PI3K/AKT通路在响应循环机械拉伸对NP细胞影响中的作用。研究结果可能提供潜在的靶点和逆转IVDD退行性变化的可能性。

循环机械拉伸通过促进ITGA2/PI3K/AKT信号通路改善髓核细胞退变


循环机械拉伸促进NP细胞增殖和细胞周期进程


研究首先以0.1 Hz,10% 的拉伸幅度对NP细胞进行8640次循环拉伸应力( 2秒拉伸,5秒保持,2秒恢复,1秒休息为1个循环),探讨了循环机械拉伸对NP细胞生物学功能的影响。结果表明,拉伸应力组NP细胞形状不规则,生长状态完整,折光性强。然后评估了循环机械拉伸对NP细胞增殖的影响。如图1 a,NP细胞在拉伸应力组的生长速度显著高于对照组。然后,通过流式细胞术分析了循环机械拉伸对细胞周期的影响。拉伸应力组和对照组G1期、S期和G2/M期NP细胞的百分比分别为41.22±5.17% vs 41.71%±2.45%、20.74±2.32% vs 32.47±1.95%、22.27±2.91% vs 15.53±0.78%(图1 c、d)。与对照组相比,拉伸应力组S期NP细胞百分比显著降低(图1 b)。拉伸应力组G2/M期NP细胞百分比显著高于对照组(图1 b)。这些结果表明,循环拉伸应力显著促进了NP细胞从S期向G2/M期的细胞周期转变。

循环机械拉伸通过促进ITGA2/PI3K/AKT信号通路改善髓核细胞退变

图1 循环机械拉伸对NP细胞增殖和细胞周期的影响。

(a) MTS测定显示,循环机械拉伸促进NP细胞增殖。(b)循环机械拉伸显著促进了NP细胞从S期向G2/M期的进展。(c)流式细胞术结果显示对照组中G1,S和G2/M期NP细胞的百分比。(d)流式细胞术结果显示拉伸应力组中 G1、S 和 G2/M 期 NP 细胞的百分比。


循环机械拉伸抑制NP细胞凋亡


接下来分析了循环机械拉伸对NP细胞凋亡的影响。拉伸组和对照组NP细胞凋亡百分比分别为8.99±0.88%和10.75±0.40%(图2 a、b)。与对照组相比,拉伸组凋亡NP细胞百分比较低(图2 c),表明循环机械拉伸抑制了NP细胞的凋亡。


这些结果表明,循环机械拉伸可能通过调节NP细胞的增殖、细胞周期和凋亡来影响NP的退变。综合以往报道的研究,研究结果表明,高机械拉伸可能会促进NP细胞凋亡和变性,而适度的机械拉伸可能会抑制NP细胞凋亡,促进NP细胞增殖,并可能改善NP变性。

循环机械拉伸通过促进ITGA2/PI3K/AKT信号通路改善髓核细胞退变

图2 循环机械拉伸对NP细胞凋亡的影响。

(a)通过流式细胞术分析的对照组中凋亡NP细胞的百分比。(b)通过流式细胞术分析的拉伸应力组中凋亡NP细胞的百分比。(c)循环机械拉伸抑制NP细胞的凋亡。


循环机械拉伸刺激 NP 细胞中的差异表达基因


为了阐明循环机械拉伸影响NP细胞的机制,进行了微阵列分析以检查响应循环机械拉伸的效应基因。结果显示,拉伸组与对照组共有689个候选基因表达存在显著差异,其中333个基因表达上调,356个基因表达下调。


然后进行了GO功能注释,该分析由三个主要分支组成,即生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞组成(CC)。结果显示,BP类主要基因为基因表达、细胞增殖分裂、凋亡过程的正向调控,MF类基因以ECM结构成分为主,CC类包括粘附斑和ECM。NP细胞增殖、凋亡和ECM代谢异常已被证明会导致NP变性。微阵列结果显示,参与这些生物学功能和过程的具有显著差异表达的基因与NP变性密切相关。


此外,还基于KEGG数据库分析了与信号通路相关的所有差异表达基因(DEG)的参与情况。在与循环机械拉伸刺激相关的十大富集信号通路中通路PI3K/AKT。据报道,PI3K/AKT通路参与NP细胞凋亡、衰老和ECM降解的调节,与NP变性显著相关。基于上述实验结果,PI3K/AKT信号通路可能在循环机械拉伸介导的NP细胞效应中发挥重要作用。


共发现31个参与PI3K/AKT信号通路的基因,在两组之间的表达存在显著差异。其中,18个基因是该通路的阳性效应子,显著上调。相反,13个负向调节该通路的基因,明显下调。因此进一步进行了qRT-PCR以确认微阵列结果。结果显示,与对照组相比,拉伸组NP细胞中ITGA2、FGF1、COL2A1和BCL2L11的mRNA水平显著升高,MYC和IL7R mRNA水平明显降低。这些结果进一步支持了从微阵列数据中得到的发现。


ITGA2/PI3K/AKT 通路参与循环机械拉伸介导的对 NP 细胞的影响


整合素被广泛认为是IVD细胞机械转导过程中的主要机械感受器。整合素通路在脊索细胞对机械负荷诱导的IVDD的易感性中起重要作用。ITGA2,也称为整合素A2,编码胶原蛋白和其他相关蛋白质的跨膜受体的α亚基。整合素α2β1参与雌激素干预的PI3K/AKT通路,调节椎间盘老化和变性的抗凋亡作用,参与FAK/PI3K信号传导,调节IVD变性中NP细胞的粘附能力和失巢凋亡。然而,ITGA2在循环机械拉伸对NP细胞变性的影响中的作用尚未阐明。


在这项研究中,进行了蛋白质印迹以进一步证实循环机械拉伸对NP细胞中ITGA2 / PI3K / AKT信号传导过程的影响。蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,拉伸应力组ITGA2和p-AKT蛋白的表达水平显著高于对照组(图3 a),表明循环机械拉伸显著促进了NP细胞中的ITGA2/PI3K/AKT信号通路。


为了进一步证实循环机械拉伸对ITGA2 / PI3K / AKT信号通路的功能影响,使用siRNAs敲低NP细胞中该通路中关键分子的蛋白质表达,即ITGA2和AKT。结果显示,ITGA2和AKT蛋白显著降低(图3 b),表明ITGA2/PI3K/AKT信号通路受到抑制。当NP细胞加载循环机械拉伸时,ITGA2和AKT表达没有明显变化。然后实验确定了NP细胞增殖。该通路的抑制显著抑制了NP细胞的增殖(图3 c),而循环机械拉伸对转染siRNA-ITGA2/AKT的NP细胞增殖没有显著影响。这些结果表明,ITGA2/PI3K/AKT信号通路在循环机械拉伸对NP细胞增殖的影响中起关键作用。


有趣的是,发现循环机械拉伸提高了NP细胞中COL2A1蛋白的表达(图3 a)。在敲低ITGA2/PI1K/AKT信号通路后,COL2A1蛋白表达显著降低(图3 b)。COL2A1是NP组织中ECM的主要成分,被认为是IVD变性的关键分子。这些结果表明,循环机械拉伸可以通过ITGA2/PI3K/AKT信号通路调节COL2A1的表达,并改善NP细胞的退变。


循环机械拉伸通过促进ITGA2/PI3K/AKT信号通路改善髓核细胞退变

图3 PI3K-AKT通路参与循环机械拉伸介导的对NP细胞的影响。

(a)循环机械拉伸促进了NP细胞中的PI3K-AKT通路。ITGA2、p-AKT、AKT和COL2A1的蛋白表达在拉伸应力组中上调。(b)抑制PI3K-AKT通路。蛋白质印迹分析显示转染siRNA-ITGA2 / AKT的NP细胞中ITGA2和AKT蛋白表达的下调。COL2A1蛋白表达显著降低。循环机械拉伸对转染siRNA-ITGA2/AKT的NP细胞中ITGA2、AKT和COL1A2的表达没有显著影响。(c)PI3K-AKT通路的下调显著抑制了NP细胞的增殖。当PI3K-AKT通路受到抑制时,循环机械拉伸对NP细胞的增殖没有显著影响。


综上所述,循环机械拉伸促进了NP细胞增殖和细胞周期从S期向G2期的转变,并抑制了NP细胞的凋亡。微阵列分析结果显示,689个基因具有显著的差异表达。对调控信号通路中所有DEGs的富集分析发现了PI3K/AKT通路。结果进一步表明,循环机械拉伸通过调节ITGA2/PI3K/AKT信号通路促进细胞增殖和COL2A1表达,改善NP细胞的退变。这些研究结果可能提供潜在的靶点和通过逆转退行性变化来治疗IVDD疾病的可能性。




参考文献:Wang D, Chen Y, Cao S, Ren P, Shi H, Li H, Xie L, Huang W, Shi B, Han J. Cyclic Mechanical Stretch Ameliorates the Degeneration of Nucleus Pulposus Cells through Promoting the ITGA2/PI3K/AKT Signaling Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2021 Mar 16;2021:6699326. doi: 10.1155/2021/6699326. PMID: 33815660; PMCID: PMC7990548.

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33815660/




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