EZH2调节皮肤再生与机械拉伸持续时间之间的相关性

医学和社会都迫切需要改进重大皮肤受损或缺陷的治疗方法。自 1982 年以来，通过持续的机械拉伸（3-5个月）诱导皮肤再生，皮肤组织扩张已被证明是一种有效和必要的皮肤缺损治疗方法。机械拉伸及其如何诱导细胞增殖一直是一个热门话题。信号换能器，如MAPK、整合素、细胞外信号调节激酶 1/2 和蛋白激酶 B 被发现在角质形成细胞中被短期（不超过7天）机械刺激激活。研究表明，主要的转录因子YAP被证明可以在各种细胞中转导机械信号，是控制表皮增殖的关键调节因子。然而，关于长期（LT）机械拉伸对滤泡间表皮干细胞（IFESC）激活和增殖的影响知之甚少。但上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科的一项研究发现，皮肤再生与机械拉伸持续时间之间存在一种意想不到的相关性。

机械拉伸对IFESCs增殖的调控具有时间依赖性

实验首先研究机械拉伸（0.5HZ，10%伸长率）对皮肤再生的影响。结果发现，短期（1个月）机械拉伸促进了表皮增殖，拉伸的表皮基底细胞中增殖细胞核抗原和p63（表皮增殖细胞标志物）、角蛋白（K）5、K14和K15（表皮基底细胞标志物）的免疫染色增加（图1 a、b）。然而，LT拉伸（5个月）导致增殖细胞核抗原、K5、K14和p63 的免疫染色降低（图1 a、b）。这项临床研究的结果表明，机械拉伸诱导的皮肤再生具有时间相关性。

接下来，研究人员在体外IFESCs中建立了一个LT拉伸模型。结果发现，在72小时内，机械拉伸比未拉伸对照组引起的增殖率更高，这与之前的报告一致。然而，IFESCs的细胞增殖和集落形成能力在7周后显著降低（图1 c、d），K5和ΔNP63的表达也降低（图1 e-g）。以上结果清楚地证明了机械拉伸持续时间对皮肤再生的两种不同影响，即短期与LT效应。

研究推测，LT机械拉伸诱导的皮肤细胞生长停滞可能归因于机械拉伸诱导的表观遗传修饰。为了测试这一点，需要鉴定IFESCs中机械转导的靶基因。YAP被证明可以在表皮中转导机械信号，不同的刺激对生长的调控也是通过不同的YAP靶基因实现的，即使在单细胞类型中。因此，首先确定了YAP在机械转导中的靶基因。结果表明，只有KLHL21敲低显著抑制了由机械力学而不是其他基因诱导的IFESCs的增殖，而且KLHL21与IFESCs增殖呈正相关。YAP或KLHL21的抑制都可以显著抑制IFESCs在体内的增殖。此外，还分析了YAP和KLHL21在体外LT机械拉伸过程中的蛋白表达。结果发现，YAP和KLHL21在拉伸1周后增加，但在7周拉伸后恢复到与基础水平相似的水平。这些结果表明，短期机械拉伸能够触发YAP的激活和核积累，诱导KLHL21的表达，从而促进IFESCs的增殖。

图1 机械拉伸对IFESCs增殖的时间依赖性调控。

LT机械拉伸增加H3K27me3修饰

接下来，实验检测了YAP靶基因的表观遗传状态。有趣的是，在LT拉伸组中，在靶基因之一EGR3的基因体中，两个位点被鉴定为高甲基化。在排除DNA甲基化后，研究了组蛋白H3K27的三甲基化状态（组蛋白H3K27位点的三甲基化被认为是转录抑制的标志）。在体外发现，LT拉伸显著提高了KLHL21启动子中的H3K27me3水平（图2 c）。在体内发现，拉伸5个月的表皮基底细胞中KLHL21启动子中的H3K27me3显著升高（图2 d）。因此，测试了已知控制H3K9或H3K27甲基化的各种赖氨酸甲基转移酶和去甲基化酶的表达。在检查的赖氨酸甲基转移酶中，H3K27me3表观遗传调控因子PRC2的催化亚基EZH2在LT拉伸的IFESCs中增加。与用于H3K4或H3K30的赖氨酸甲基转移酶相比，在IFESCs中，只有EZH2被LT拉伸上调（图2 e、f）。这些结果表明，LT机械拉伸增加了EZH2的表达，从而诱导了表观遗传修饰（H3K27me3）。而这是否是LT机械拉伸导致IFESCs生长停滞的原因，还有待研究。

图2 LT机械拉伸诱导H3K27me3修饰。

EZH2过表达抑制IFESC增殖

为了测试上述疑问，实验在IFESCs中过度表达了EZH2。EZH2过表达导致EZH2和H3K27me3表达增加，KLHL21表达降低（图3 a、b）。实验还通过抑制集落形成能力（图3 c）和细胞增殖（图3 d）观察到了同样预期结果。此外，在EZH2过表达的细胞中，短期拉伸诱导的YAP核易位也减少（图3 e、f）。荧光素酶报告基因测定表明，当EZH2过表达时，组成型活化的YAPS127A 与 KLHL21启动子区域的结合被阻断（图3 g）。这些结果证实了，EZH2的过表达抑制了IFESC的增殖。

图3 EZH2过表达在体外抑制IFESC增殖。

抑制EZH2挽救LT机械拉伸诱导的生长停滞

EZH2的药理学抑制剂—GSK343，用于测试抑制EZH2是否能挽救LT机械拉伸诱导的IFESC生长停滞。体外实验表明，GSK343对YAP、KLHL21和EZH2的蛋白表达没有影响（图4 a）。LT机械拉伸降低了YAP的核易位，并且在GSK343干预后明显阻断了这种效应（图4 b、c）。此外，GSK343（1μM，7周）降低了H3K27me3水平（图4 d），并挽救了LT拉伸后IFESCs中降低的KLHL21表达（图4 e）和集落形成能力（图4 f）。在体内，GSK343皮内注射（10μM，4周）导致表皮厚度增加（图4 g），K14和ΔNP63表达增加，并减少每毫米表皮毛囊数量（图4 h）。免疫荧光染色显示，GSK343诱导了更多的K5- 和P63- 阳性基底细胞，表皮厚度增加（图4 i）。这些体外和体内研究表明，EZH2抑制剂可以抑制H3K27me3的形成，挽救IFESCs的增殖停滞。这些阐明了LT机械拉伸可以增加EZH2表达，从而诱导表观遗传修饰（H3K27me3），这就是LT机械拉伸导致IFESC生长停滞的原因（图4 j）。

图4 抑制EZH2可挽救LT机械拉伸诱导的生长停滞。

综上所述，这项研究表明，干细胞增殖与EZH2调控的机械拉伸持续时间之间存在意想不到的相关性。这项诱导细胞生长停滞的长期机械拉伸的研究为临床转化促进皮肤再生提供了一种策略。

参考文献：Wang J, Zhang Y, Gao Y, Shan S, Li Q. EZH2 Regulates the Correlation between Skin Regeneration and the Duration of Mechanical Stretch. J Invest Dermatol. 2021 Apr;141(4):894-902.e9. doi: 10.1016/j.jid.2020.09.007. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33069730.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33069730/

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