CXC-受体2在机械应变下促进细胞外基质的产生并减弱视盘周围人巩膜成纤维细胞的迁移

眼压（IOP）是青光眼病理生理学的主要危险因素，不仅影响视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡，还影响视神经乳头（ONH）的生物力学行为。筛板（LC）和视盘周围巩膜（PPS）主要构成ONH复合体，可能对青光眼的发展进展有较大影响。最近的发现引起了人们对高血压巩膜（hypertensive sclera）的生物力学特性的兴趣，并探索了它与青光眼的关系。

细胞外基质（ECM）对于巩膜维持眼压产生的张力很重要。眼压升高可能会增加小鼠巩膜中的纤维成分（如胶原蛋白）并减少非纤维成分。 因此可以推测，高血压性巩膜改变可能表明ECM的合成而不是降解，至少在早期阶段是这样。驻留在巩膜中的细胞的反应是关键点。因此，对巩膜ECM重塑驱动力的机制洞察需要在体外机械应变下对人巩膜成纤维细胞（HSFs），特别是视盘周围HSFs（ppHSFs）进行详细研究。为了研究高血压PPS的ECM重塑，有必要在体外建立适当的ppHSFs应变模型，以模拟体内眼高压。

因此，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院、卫生部近视眼重点实验室、上海交通大学医学院附属新华医院骨科等联合团队的一项研究旨在（1）探索ppHSFs在体外合适的双轴机械应变;（2）筛选pHSFs在拉伸应变下的机械刺激基因;（3）研究CXCR2在机械应变下对细胞行为和ECM产生的影响。

多种机械应变下 ppHSFs 的 mRNA 和蛋白表达

为了探索合适的应变参数，在ppHSFs上施加了多个双轴力学应变，幅度分别为：0；5%，0.5Hz；10%，0.5Hz；20%,0.5Hz，持续8h和24h。结果表明，这些基因在不同应变的影响下发生了动态变化。与对照相比，随着机械应变的逐渐加强，I~IV型胶原蛋白、弹性蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA水平呈先升高后下降的趋势，而MMP2、核心蛋白聚糖、纤连蛋白和双糖链蛋白多糖的转录表达显著降低。

多种应变下ppHSFs中I型胶原蛋白和MMP2的蛋白表达与转录水平一致。作为巩膜中的主要成分，I型胶原蛋白占巩膜干重的90%以上。在 5% 0.5 Hz、10% 0.5 Hz、20% 0.5 Hz 应变 8h和 24h下，I型胶原蛋白的折叠变化分别为1.59±0.36、1.62±0.39、0.58±0.13、1.12±0.18、0.90±0.13、1.40±0.36。与近视一样，MMP2也可能在调节眼高压期间的巩膜重塑中起着至关重要的作用。MMP2的相对蛋白水平分别为0.45±0.10、0.60±0.16、0.83±0.17、0.91±0.11、1.17±0.22、0.99±0.19倍变化。

研究表明，高血压巩膜显示纤维成分增加，非纤维成分减少，伴随巩膜硬度增加和巩膜通透性降低。初步实验还证实了大鼠慢性眼高压模型中巩膜I型胶原蛋白和弹性蛋白的产生上调，至少在早期阶段是这样。总之，10% 0.5Hz的应变持续8小时可能是合适的ppHSFs的应变条件，以模仿体内高血压巩膜ECM的产生。

机械刺激和未刺激的 ppHSFs 之间的 RNA 序列和 mRNA 表达谱

接下来比较机械刺激（10% 0.5 Hz，持续8小时）和未刺激的ppHSFs之间的mRNA表达。机械拉伸后转录组发生巨大改变（图1 A）。结果表明，机械刺激触发了促炎细胞因子簇，尤其是CXC配体和受体。因此进一步确认了CXC家族（CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL12，CXCR2，CXCR5）在应变后哪个差异表达最大（图1 B）。

异常刺激的CXCLs与ppHSFs中的上调CXCR2相结合，然后CXCR2可能将外部机械信号转导为细胞内生物信号，调节下游信号通路，从而启动炎症级联反应并改变细胞行为。此外还进行了蛋白质印迹分析以可视化应变下CXCR2的蛋白表达（图1 C‐D）。因此，CXCR2可能是机械应变下ppHSFs的重要靶点。

为进一步研究CXCR2在ppHSFs中的功能，建立了含有人CXCR2基因shRNA的慢病毒载体。选择shRNA1进行后续实验，因为它在敲低CXCR2方面更有效（图1 E-G）。

图1 机械刺激和未刺激的ppHSFs之间的RNA序列和mRNA表达谱。

机械刺激的CXCR2促使ppHSFs在机械应变下增殖

在10% 0.5 Hz的应变下持续8 h，在ppHSFs中CXCR2的表达上调。然而，CXCR2对ppHSFs的影响尚未得到很好的探索。因此实验检测了细胞增殖能力。与未刺激的对照相比，刺激组中阳性Edu细胞（绿色）的比例增加，表明细胞增殖加快（图2 A、B）。细胞周期分析也显示ppHSFs中的G2和S期显著增加（图2 C、D）。数据还显示，当CXCR2上调时，AKT，STAT3和ERK1/2的磷酸化增加，这可能解释了机械刺激的细胞增殖（图2 E、F）。免疫荧光成像显示磷酸化的STAT3在相同情况下发生细胞核易位（图2 G）。当CXCR2表达被shRNA敲低时，两组之间的Edu成像没有显著变化。因此，CXCR2可能在机械应变下促进ppHSFs的细胞增殖。

图2 机械刺激上调的CXCR2促使ppHSFs的细胞增殖。

机械刺激的 CXCR2 通过 Jak1/2‐STAT3 信号通路在机械应变下增加了 ppHSFs 中巩膜 ECM 的产生

为了探讨CXCR2对巩膜ECM的mRNA和蛋白质产生的影响，进行了qPCR和蛋白质印迹。结果表明，应变刺激的CXCR2上调增加了I型胶原蛋白的mRNA和蛋白质产生，减少了siRNA对照组中MMP2的产生。当CXCR2表达受到抑制时，机械刺激后I型胶原蛋白和MMP2的mRNA和蛋白质产生被逆转（图3 A-C）。CXCR2还可以调节I型胶原蛋白的分泌水平和MMP2的活性。当CXCR3被敲低时，应变下磷酸化的STAT2的易位也减弱（图3 D、E）。

通过应用JAK2/3抑制剂芦可替尼也可以消除应变下I型胶原蛋白的增加，MMP1的减少和STAT2磷酸化的激活。因此，可以推测，机械刺激的CXCR2可能通过JAK1 / 2-STAT3信号通路调节ppHSFs中巩膜ECM的产生。

图3 机械刺激的CXCR2增加了机械应变下ppHSFs的巩膜ECM产生。

CXCR2 对 ppHSFs 细胞凋亡的影响

采用膜联蛋白V/PI双重染色的流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果表明，ppHSFs的凋亡在应变下略有降低，但无统计学意义。在shRNA干扰组中，应变后CXCR2的表达受到抑制，凋亡细胞明显减少。结果表明，抑制 CXCR2可能降低ppHSFs的凋亡。

机械刺激的 CXCR2 通过 FAK/MLC2 通路减弱了机械应变下 ppHSFs 的细胞迁移

对于细胞迁移率，进行迁移测定。在siRNA对照组中，在有或无应变条件下，ppHSFs在划痕后24h的迁移量分别占总迁移量的38.65% 和 59.16%。在shRNA组中，在有或无应变条件下，细胞的迁移量分别占总迁移量的 34.06% 和 37.12%（图4 A、B）。在机械应变作用下，CXCR2的上调增加了磷酸化的FAK，但抑制了磷酸化的MLC2，从而降低了ppHSFs的迁移能力。然而，当CXCR2被敲低时，FAK和MLC2的磷酸化在应变后没有显著变化（图4 C、D）。因此，CXCR2可能会影响ppHSFs在机械应变下的迁移能力。

此外，还应用了FAK抑制剂和DMSO。在对照（DMSO）组中，细胞迁移在机械应变下减慢。FAK的磷酸化上调，MLC2的磷酸化下调，与CXCR2 siRNA对照组的结果一致。然而，细胞迁移和MLC2的磷酸化在应用FAK抑制剂后恢复。总之，CXCR2可能通过FAK/MLC2信号通路抑制ppHSFs在应变下的迁移。

图4 机械刺激的CXCR2在机械应变下延缓了ppHSFs中的细胞迁移。

综上所述，该研究表明，10% 0.5 Hz 持续 8 小时的应变可能是 ppHSFs 重现体内高血压巩膜重塑的适当条件。在这种机械应变下，ppHSFs可能会经历复杂的炎症过程，至少在早期是这样。上调的CXCR2可以促进细胞增殖，通过JAK1/2-STAT3信号通路调节I型胶原和基质金属蛋白酶2的mRNA和蛋白表达，并通过FAK/MLC2通路抑制细胞迁移。机械转导的机制可能值得进一步研究，包括microRNA等作用。机械应变可能诱导细胞microRNA的显著变化，这表明microRNA可能是在机械刺激下调节ppHSFs的机制之一。总之，从巩膜疗法的角度来看，CXCR2可能是青光眼的潜在治疗靶点。

参考文献：Qiu C, Wang C, Sun X, Xu J, Wu J, Zhang R, Li G, Xue K, Zhang X, Qian S. CXC- receptor 2 promotes extracellular matrix production and attenuates migration in peripapillary human scleral fibroblasts under mechanical strain. J Cell Mol Med. 2022 Dec;26(23):5858-5871. doi: 10.1111/jcmm.17609. Epub 2022 Nov 8. PMID: 36349481; PMCID: PMC9716229.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36349481/

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