MTORC1协调骨关节炎颞下颌关节软骨细胞的自噬与凋亡信号

骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，会破坏关节软骨。生物力学因素在OA的发病机制中起重要作用。颞下颌关节（TMJ）在生物力学上与牙齿咬合有关，是OA损伤的多发部位。

第四军医大学口腔医学院、南方医科大学第三附属医院、广东省细胞微环境与疾病研究重点实验室及美国拉什大学医学中心骨科的一项联合研究曾报道了流体剪切应力（FFSS）在体外诱导TMJ软骨细胞死亡。此外还开发了一种称为单侧前交叉（UAC）的体内异常牙齿咬合模型，并证明它诱导大鼠和小鼠颞下颌关节软骨中的软骨细胞死亡和OA样病变。这些体外和体内模型有助于研究异常生物力学诱导软骨细胞死亡和颞下颌骨关节炎发作的分子机制。然而，UAC是否可以诱导TMJ OA软骨中的内质网应激（ERS）凋亡仍未知。

细胞暴露于广泛的负荷会导致钙过载和ER腔中错误折叠蛋白质的积累，称为ER应激（ERS）。该ERS由三种ER跨膜蛋白检测，包括EIF2AK3（真核翻译起始因子2α激酶3），ERN1 / IRE1（内质网到核信号转导1）和ATF6（激活转录因子6）。自噬是一种细胞自我消化过程，并且与ERS密切相关。它决定了细胞内细胞器和蛋白质的周转，被认为是OA中细胞存活的重要机制。

MTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）是一种高度保守的蛋白激酶，形成两种不同的功能复合物，即MTOR复合物1（MTORC1）和MTORC2。MTORC1是雷帕霉素的敏感靶标，被TSC1/2（结节性硬化症复合体1/2）抑制，TSC1/2是自噬的负调节因子，可作为MTORC1的上游抑制因子，以降低小鼠实验性OA的严重程度。据报道，雷帕霉素激活自噬可防止人软骨细胞出现OA样病变和OA小鼠模型中的延迟关节软骨退化。

在这项研究中，该团队使用先前建立的体内和体外模型以及两个遗传小鼠模型，研究了自噬和ERS凋亡是否都参与生物力学诱导的TMJ OA病变的进展。此外，进一步研究了在TMJ OA进展中，MTORC1是否在软骨细胞中将ERN1介导的自噬通量转换为EIF2AK3介导的ERS的凋亡程序中发挥作用。

首先，实验表明了，UAC在颞下颌关节OA进展的整个过程中诱导ERS凋亡，同时在早期诱导自噬，但在晚期抑制自噬。MTORC1是一种众所周知的自噬抑制剂，在早期被抑制，但在晚期被激活，这表明它在UAC诱导的TMJ OA软骨病变的进展中在将自噬转变为ERS凋亡中发挥作用。

接下来，利用体外流动剪切应力（FFSS）模型系统来确定机械力对ATDC5软骨细胞样细胞中ERS凋亡和自噬途径的影响。结果表明，FFSS对软骨细胞中的钙内流和ERS有影响。

然后研究了FFSS是否诱导ATDC5细胞中的ERS凋亡和自噬。细胞用FFSS（24 dyne/cm2）处理1、2和4小时。结果显示，未经FFSS处理的ATDC5细胞呈多边形，具有大且未浓缩的细胞核，其ER连续且紧凑，细胞质中的囊泡很少。FFSS导致ATDC5细胞中ER的扩增，随着时间的推移而加剧。还观察到含有不完全消化的细胞器和溶酶体酶颗粒，特别是在处理1和2小时。

通过qPCR分析和蛋白质印迹显示，TUNEL阳性细胞的数量增加，CASP12和DDIT3在FFSS处理的细胞中的表达水平上调，HSPA5和p-EIF2AK3的表达水平在1至4小时水平上调。然而，p-ERN1、BECN1和LC3B-II的表达水平在1和2 h时升高，但在4 h时没有增加。p-MTOR和p-RPS6的表达水平在1和2 h时降低，但在4 h时没有降低（图1 a、b），而SQSTM1水平在1和2 h时降低，但在4 h时升高。LAMP2的表达水平在整个时间过程中升高（图1 c）。IF染色结果显示，LC3B-II和LAMP2在1和2 h时共定位点增加，但4小时没有增加（图1 d）。巴佛洛霉素A1抑制自噬体与溶酶体融合，在2 h时增加LC3B-II的表达水平，但4 h不增加，且不影响p-MTOR和p-RPS6的表达（图1 e、f）。

这些结果表明，FFSS在整个实验过程中激活ERS细胞凋亡，在早期激活自噬通量，但在后期抑制自噬通量，MTORC1可能参与这一过程的调节。

图1 FFSS激活自噬通量，但使培养的ATDC5细胞中的MTORC1通路失活

（a）ATDC5细胞暴露于24 dyne/cm2 的FFSS于指定时间，蛋白质印迹用于测量蛋白质表达。（b）（a）的定量数据。（c）蛋白质印迹法检测 SQSTM1/p62 和 LAMP2 的蛋白表达，用于检测自噬通量。（d）ATDC5细胞按（a）中处理。IF染色用于定位自噬体和溶酶体。（e）用巴佛洛霉素A1 和FFSS 刺激 2 和 4 小时处理的 ATDC5 细胞的 IF 染色。（f）蛋白质印迹法用于 ATDC5 细胞中的蛋白质表达，这些细胞经受 24 dyne/cm2 FFSS 2 和 4 小时，有或没有巴佛洛霉素A1处理。

MTORC1促进p-EIF2AK3介导的ERS凋亡，但抑制FFSS处理的软骨细胞中的自噬通量

为了研究MTORC1下游靶点EIF2AK3是否在软骨细胞中FFSS诱导的ERS凋亡和自噬程序中发挥作用，实验在培养基中加入p-EIF2AK3抑制剂GSK2606414进行2和4小时FFSS处理实验。结果表明，GSK2606414降低了FFSS增加的CASP12、DDIT3和p-EIF2AK3表达以及TUNEL阳性细胞，促进了LC3B-II和LAMP2的共定位，降低了SQSTM1的表达。它不影响p-MTOR、p-RPS6、HSPA5和p-ERN1的表达，并且在2小时时没有逆转FFSS增加的LC3B-II和BECN1表达，尽管它在4小时抑制了LC3B-II的表达。

接下来研究了MTORC1是否在FFSS诱导的ERS凋亡和自噬中发挥作用，方法是在2和4小时或1和2小时FFSS刺激之前，在ATDC5细胞培养基中添加雷帕霉素（MTORC1的抑制剂）或MHY1485（MTORC1的激活剂）。结果表明，雷帕霉素处理在2和4 h抑制了FFSS处理的ATDC5细胞中p-MTOR和p-RPS6的表达水平，并降低了FFSS刺激的细胞凋亡和p-EIF2AK3、CASP12和DDIT3表达。MTORC1激活剂MHY1485表现出相反的效果。

总的来说，这些结果表明MTORC1通过上调抑制自噬体-溶酶体融合的p-EIF2AK3来抑制自噬体形成的启动并促进ERS凋亡。

p-ERN1抑制MTORC1以减弱FFSS处理的软骨细胞中的ERS凋亡

为了进一步研究ERN1在ERS凋亡和自噬过程中调节MTORC1中的作用，ATDC5细胞感染表达ERN1的慢病毒，并在存在或不存在MHY1485的情况下进行4小时FFSS。结果表明，ERN1过表达抑制p-MTOR和p-RPS6的表达，上调BECN1和LC3B-II并促进软骨细胞自噬，但下调p-EIF2AK3、CASP12和DDIT3，抑制FFSS诱导的软骨细胞凋亡，而不影响HSPA5表达（图2 a-f）。MHY1485逆转了ERN1抑制的p-MTOR和p-RPS6的表达，抑制自噬，促进ERS凋亡，而不影响HSPA5表达（图2 d-f）。有趣的是，p-PRKAA1/2（蛋白激酶）在体内4周UAC组中上调，在体外2小时FFSS组上调（图2 g-i）。A769662激活p-PRKAA1/2逆转了4μ8C（p-ERN1的抑制剂）对自噬的抑制作用（图2 h、i）。这些结果表明，p-ERN1通过p-PRKAA1/2（AMPK）途径抑制MTORC1来抑制FFSS处理的软骨细胞中ERS凋亡，但促进自噬。

图2 p-ERN1抑制MTORC1以减弱FFSS处理的软骨细胞中的ERS凋亡

（A-F）ATDC5细胞用4μ8C（1 μM）、雷帕霉素（100 nM），4μ8C（1 μM）+雷帕霉素（100 nM），ERN1慢病毒感染（ACT）或ACT + MHY1485（100 nM）处理。两小时后，对细胞进行FFSS（24 dyne/cm2）4小时，然后进行蛋白质印迹（a、b、d、e）和qPCR分析（c）以表达指示基因，或TUNEL染色以表达细胞凋亡（f）。（g） 在 4 周和 8 周使用针对 p-PRKAA1/2 的抗体进行 IHC 染色。（H、I）用1 μM 4μ8C或1 μM A769662处理或两者对ATDC5细胞中的指示标志物进行蛋白质印迹分析。

抑制MTORC1促进自噬并抑制UAC刺激的颞下颌关节软骨细胞的凋亡

通过删除小鼠MTORC1表达，进一步确定了MTORC1失活对UAC诱导的颞下颌关节软骨软骨自噬和细胞凋亡的影响。数据表明，在假手术组中，MTORC1缺失降低了软骨细胞中p-RPS6蛋白的水平，并增加了safranin O染色显示的基质量。MTORC1的缺失激活了自噬程序，如BECN1和LC3B-II表达的增加以及LC3B-II和LAMP2在软骨细胞中的共定位所证明的那样。然而，它没有显著改变p-EIF2AK3，裂解的CASP3，CASP12，DDIT3和TUNEL阳性细胞数量的表达。软骨细胞中MTORC1的缺失显著减少了UAC诱导的7周时颞下颌关节软骨丢失。重要的是，MTORC1活性的缺失显著降低了UAC刺激的p-EIF2AK3，裂解的CASP3，CASP12和DDIT3的表达水平以及TUNEL阳性细胞的数量增加，但增加了BECN1和LC3B-II蛋白在UAC处理的软骨中的表达水平（图3 h-l），表明抑制MTORC1促进自噬并抑制UAC刺激的颞下颌关节软骨细胞的凋亡。

图3 MTORC1失活促进软骨细胞自噬，抑制软骨细胞凋亡，防止UAC下的软骨丢失

（h）软骨细胞中MTORC1的软骨特异性缺失。小鼠接受UAC或假手术7周，并按照材料和方法中所述注射TM。IF染色：颞下颌关节矢状中央切片用p-RPS6抗体染色（S235/236）。p-RPS6：红色；DAPI：蓝色。（i-l）（h）的量化。

通过注射MHY1485或Tsc1的基因缺失激活MTORC1抑制自噬并促进软骨细胞凋亡，并增强UAC诱导的TMJ软骨丢失

实验最终通过删除软骨细胞中MTORC1的上游负调节因子TSC1的表达来研究MTORC1的激活对UAC诱导的TMJ软骨细胞自噬和凋亡的影响。正如预期的那样，在UAC-假手术组中，Tsc1的缺失上调了软骨细胞中p-RPS6蛋白的水平，增加p-EIF2AK3、CASP12、DDIT3和裂解CASP3的表达，但降低BECN1和LC3B-II的表达，抑制LC3B-II和LAMP2的共定位，降低软骨基质量。在UAC处理组中，Tsc1的缺失逆转了UAC抑制的p-RPS6表达，并进一步上调了UAC刺激的p-EIF2AK3、CASP12、DDIT3和裂解CASP3的表达，但降低了UAC刺激的BECN1和LC3B-II的表达，并增强了UAC诱导的OA样表型，包括关节软骨的急剧丢失和颞下颌关节软骨中蛋白多糖数量的减少。总的结果表明，通过注射MHY1485或Tsc1的基因缺失激活MTORC1抑制自噬并促进软骨细胞凋亡，并增强UAC诱导的TMJ软骨丢失。

图4 工作模型表明了MTORC1在ERS凋亡和自噬通量之间的串扰中的作用

UAC-FFSS诱导钙过载，并通过上调p-EIF2AK3和p-ERN1来促进ERS。自噬通量由ERN1-MTORC1信号启动，ERS凋亡由软骨细胞中的MTORC1-EIF2AK3诱导。MTORC1，p-ERN1-p-PRKAA1/2 （AMPK） 的下游，通过上调 p-EIF2AK3 响应于长时间的异常生物力学负荷，将软骨细胞的自噬切换到 ERS-凋亡，这促进了 CASP12 和 DDIT3 的表达，从而导致细胞凋亡并通过抑制自噬体-溶酶体融合来抑制自噬。

综上所述，该研究结果为MTORC1在LC3B-II介导的保护性自噬与p-EIF2AK3介导的软骨细胞降解ERS凋亡以响应延长的异常生物力学负荷中的作用带来了新的见解。活化的p-EIF2AK3除了通过增加CASP12和DDIT3的表达促进细胞凋亡外，还通过抑制自噬体-溶酶体的形成来抑制自噬。研究的结果通过ERN1-MTORC1-EIF2AK3信号通路的干预为OA提供了潜在的治疗靶点。

参考文献：Yang H, Wen Y, Zhang M, Liu Q, Zhang H, Zhang J, Lu L, Ye T, Bai X, Xiao G, Wang M. MTORC1 coordinates the autophagy and apoptosis signaling in articular chondrocytes in osteoarthritic temporomandibular joint. Autophagy. 2020 Feb;16(2):271-288. doi: 10.1080/15548627.2019.1606647. Epub 2019 Apr 21. PMID: 31007149; PMCID: PMC6984599.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31007149/

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